CRISPR/Cas9系统介导猪MSTN基因定点修饰研究
发布时间：2022-01-04 08:28
CRISPR是一种特殊的DNA序列重复家族,是细菌和古细菌在进化中形成的一种免疫防御系统。在CRISPR基因座的附近区域存在着一个被称为Cas蛋白的家族,它起着对外源核酸切割的功能。CRISPR/Cas9系统主要由重复序列、间隔序列（protospacers）和重复序列上游的Cas蛋白家族构成。CRISPR/Cas9系统主要有I、II、III三种类型,II型CRISPR/Cas9系统由于其构造简单,备受研究者青睐并将其改造成为对哺乳动物基因组DNA进行靶向修饰的工具,该系统对靶序列的切割只需要二聚体结构的单链导向RNA（sgRNA）和Cas9蛋白,gRNA通过引导Cas9识别含有PAM（NGG）的靶基因序列,对靶基因DNA进行双链切割,从而为同源重组介导的基因敲除制造可能。肌肉生长抑制素（myostatin MSTN）是一种分泌性多肽,属于TGF-β超家族成员,具有该家族共有的生物结构。MSTN基因是骨骼肌的负调控因子,主要通过调节哺乳动物成肌细胞的增殖影响肌肉的生长和发育。自然状态下的生物学突变以及利用基因敲除技术敲除MSTN基因的动物的肌肉量会急剧增加,产生双肌性状,生活中我们接触...
【文章来源】：长江大学湖北省
【文章页数】：42 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
猪MSTN基因打靶示意图
图 2 HRX-2MCS 载体Fig.2 HRX-2MCS vectorHRX-2MCS 载体为实验室预留，存量比较少，需转化 DH5a 感受态细胞进行增然后进行质粒提取，具体步骤为：（1）转化：将 HRX-2MCS 载体质粒转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞内。下：① -80 度冰箱内取感受态并立即置于冰水解冻 2-3min。② 取 1ng 左质粒加入到解冻好的 100 ul DH5a 感受态细胞中，用移液枪反复吹打混匀冰浴 30 min。③ 将上述步骤完成后的混合物置于 42 ℃水浴锅内热激 90间尽量不要晃动，之后立即置于冰上静置 2 min，期间尽量不要晃动。④物内加入 800ul 未添加抗生素的 LB 培养基，37℃，220r/min 摇床内培养 30⑤ 待 EP 管内有乳白色浑浊沉淀出现时取 20-50ul 菌液在无菌操作台内涂抗性的平板上，放于 37℃衡温培养箱内正置 20min 后，反置培养过夜。（2）阳性单克隆菌落挑选及培养：过夜培养后，平板上出现许多单克用无菌镊子挑取长势较好，边缘光滑的单克隆菌置于 5ml 添加氨苄抗性的
图 3 基因打靶检测示意图Fig.3 Detection diagram of gene targeting表 1 引物序列Table 1 primers used in the studyPrimer name Primer sequence(5’-3’) Size(bC1LfC1LrC2LfC2LrC1RfC1RrC2RfC2RrT1-UPGAGGAAAAAGACATTTCAACGGAAAAAGAGGGGCTGTGCCTAGTGAATGGAGGAAGGCTAACTGTGGATTTTGAAGCTGGAGACAAAACACTAAATCTCCAGGCAGGCACATGCTTAAATGGGACTGGATTATTGCGCAATGGTTGGCATTTAACCCTGGAAATCTGAGGCAAACTGC201819202021182022
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索[J]. 肖利佳,龙寿斌,罗历,沈化清,郝建华. 海南医学. 2015(01)
[2]CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J]. 康峰,卢胜明,张海峰. 实验动物科学. 2014(04)
[3]CRISPR-Cas介导的基因编辑工具[J]. 左其生,李东,张亚妮,李碧春. 生物技术通报. 2014(07)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[5]猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定[J]. 欧阳红生,孙燕,张永亮,李慎涛,张锐,廖晓萍,张玉静,赵建军,赵凤云. 中国兽医学报. 2001(05)
本文编号：3568037
【文章来源】：长江大学湖北省
【文章页数】：42 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
猪MSTN基因打靶示意图
图 2 HRX-2MCS 载体Fig.2 HRX-2MCS vectorHRX-2MCS 载体为实验室预留，存量比较少，需转化 DH5a 感受态细胞进行增然后进行质粒提取，具体步骤为：（1）转化：将 HRX-2MCS 载体质粒转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞内。下：① -80 度冰箱内取感受态并立即置于冰水解冻 2-3min。② 取 1ng 左质粒加入到解冻好的 100 ul DH5a 感受态细胞中，用移液枪反复吹打混匀冰浴 30 min。③ 将上述步骤完成后的混合物置于 42 ℃水浴锅内热激 90间尽量不要晃动，之后立即置于冰上静置 2 min，期间尽量不要晃动。④物内加入 800ul 未添加抗生素的 LB 培养基，37℃，220r/min 摇床内培养 30⑤ 待 EP 管内有乳白色浑浊沉淀出现时取 20-50ul 菌液在无菌操作台内涂抗性的平板上，放于 37℃衡温培养箱内正置 20min 后，反置培养过夜。（2）阳性单克隆菌落挑选及培养：过夜培养后，平板上出现许多单克用无菌镊子挑取长势较好，边缘光滑的单克隆菌置于 5ml 添加氨苄抗性的
图 3 基因打靶检测示意图Fig.3 Detection diagram of gene targeting表 1 引物序列Table 1 primers used in the studyPrimer name Primer sequence(5’-3’) Size(bC1LfC1LrC2LfC2LrC1RfC1RrC2RfC2RrT1-UPGAGGAAAAAGACATTTCAACGGAAAAAGAGGGGCTGTGCCTAGTGAATGGAGGAAGGCTAACTGTGGATTTTGAAGCTGGAGACAAAACACTAAATCTCCAGGCAGGCACATGCTTAAATGGGACTGGATTATTGCGCAATGGTTGGCATTTAACCCTGGAAATCTGAGGCAAACTGC201819202021182022
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索[J]. 肖利佳,龙寿斌,罗历,沈化清,郝建华. 海南医学. 2015(01)
[2]CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J]. 康峰,卢胜明,张海峰. 实验动物科学. 2014(04)
[3]CRISPR-Cas介导的基因编辑工具[J]. 左其生,李东,张亚妮,李碧春. 生物技术通报. 2014(07)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[5]猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定[J]. 欧阳红生,孙燕,张永亮,李慎涛,张锐,廖晓萍,张玉静,赵建军,赵凤云. 中国兽医学报. 2001(05)
本文编号：3568037
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3568037.html
