非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
发布时间：2022-01-07 21:13
建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×100～1.0×109拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×100拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数（CV）小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线
用建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法对1.0×100～1.0×109拷贝/μL的标准质粒进行定量敏感性检测。结果显示最低检出量为1.0×100拷贝/μL(图2),即该方法具有极高的灵敏性。2.4 特异性检测
对建立的TaqMan荧光定量RT-PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法分别进行重复性试验。以1.0×102,1.0×105,1.0×108拷贝/μL的标准质粒分别作为模板,进行3次批内与批间荧光定量RT-PCR反应扩增,同一质粒浓度的扩增Ct值在批次内与批次间都非常稳定。计算批内与批间Ct值的CV均小于1%(表2),表明所建立的方法有较好的可重复性。表2 TaqMan荧光定量RT-PCR重复性试验结果 项 目 标准质粒浓度/(拷贝·μL-1) Ct值 CV/% 批内重复 1.0×102 35.15±0.13 0.32 1.0×105 25.74±0.10 0.28 1.0×108 15.82±0.10 0.63 批间重复 1.0×102 35.37±0.19 0.67 1.0×105 25.24±0.06 0.08 1.0×108 15.23±0.08 0.45
【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟及防控技术研究现状[J]. 扈荣良,于婉琪,陈腾. 中国兽医学报. 2019(02)
[2]非洲猪瘟病毒实验室诊断方法的研究进展[J]. 林彦星,曹琛福,杨俊兴,阮周曦,吴江,吕建强,花群义. 中国兽医学报. 2018(10)
[3]我国首次非洲猪瘟疫情的发现和流行分析[J]. 陈腾,张守峰,周鑫韬,李楠,缪发明,张静远,刘晔,吕宗吉,张国军,扈荣良. 中国兽医学报. 2018(09)
[4]非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,谢金文,李峰,沈志强. 饲料与畜牧. 2017(22)
[5]5种外来动物疫病并联荧光定量PCR检测方法的研究[J]. 于恒智,刘晔,程玮,张旭东,苗富春,赵丹,张守峰,刘芳伊,牛文博. 中国动物检疫. 2016(11)
[6]一种鉴别非洲猪瘟病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立[J]. 王建华,赵祥平,董志珍,王玉玲,赵丹,肖妍,张俊哲,陈小金,王乃福,陈本龙. 中国兽医科学. 2016(01)
[7]非洲猪瘟病毒PCR检测试剂盒的研制[J]. 吴忆春. 中国兽医科学. 2012(11)
[8]非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 崔尚金,胡泉博,刘业兵. 中国预防兽医学报. 2012(10)
[9]非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 李洪利,曹金山,王君玮,张维. 中国畜牧兽医. 2012(06)
[10]非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 黄萍,肖家勇,欧阳振宇,陈盼,白雪,朱中武,孟芳,吴愈柏,唐连飞. 中国动物检疫. 2010(11)
硕士论文
[1]非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重PCR及双重荧光PCR检测方法的建立与应用[D]. 张倩.扬州大学 2010
本文编号：3575278
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线
用建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法对1.0×100～1.0×109拷贝/μL的标准质粒进行定量敏感性检测。结果显示最低检出量为1.0×100拷贝/μL(图2),即该方法具有极高的灵敏性。2.4 特异性检测
对建立的TaqMan荧光定量RT-PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法分别进行重复性试验。以1.0×102,1.0×105,1.0×108拷贝/μL的标准质粒分别作为模板,进行3次批内与批间荧光定量RT-PCR反应扩增,同一质粒浓度的扩增Ct值在批次内与批次间都非常稳定。计算批内与批间Ct值的CV均小于1%(表2),表明所建立的方法有较好的可重复性。表2 TaqMan荧光定量RT-PCR重复性试验结果 项 目 标准质粒浓度/(拷贝·μL-1) Ct值 CV/% 批内重复 1.0×102 35.15±0.13 0.32 1.0×105 25.74±0.10 0.28 1.0×108 15.82±0.10 0.63 批间重复 1.0×102 35.37±0.19 0.67 1.0×105 25.24±0.06 0.08 1.0×108 15.23±0.08 0.45
【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟及防控技术研究现状[J]. 扈荣良,于婉琪,陈腾. 中国兽医学报. 2019(02)
[2]非洲猪瘟病毒实验室诊断方法的研究进展[J]. 林彦星,曹琛福,杨俊兴,阮周曦,吴江,吕建强,花群义. 中国兽医学报. 2018(10)
[3]我国首次非洲猪瘟疫情的发现和流行分析[J]. 陈腾,张守峰,周鑫韬,李楠,缪发明,张静远,刘晔,吕宗吉,张国军,扈荣良. 中国兽医学报. 2018(09)
[4]非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,谢金文,李峰,沈志强. 饲料与畜牧. 2017(22)
[5]5种外来动物疫病并联荧光定量PCR检测方法的研究[J]. 于恒智,刘晔,程玮,张旭东,苗富春,赵丹,张守峰,刘芳伊,牛文博. 中国动物检疫. 2016(11)
[6]一种鉴别非洲猪瘟病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立[J]. 王建华,赵祥平,董志珍,王玉玲,赵丹,肖妍,张俊哲,陈小金,王乃福,陈本龙. 中国兽医科学. 2016(01)
[7]非洲猪瘟病毒PCR检测试剂盒的研制[J]. 吴忆春. 中国兽医科学. 2012(11)
[8]非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 崔尚金,胡泉博,刘业兵. 中国预防兽医学报. 2012(10)
[9]非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 李洪利,曹金山,王君玮,张维. 中国畜牧兽医. 2012(06)
[10]非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 黄萍,肖家勇,欧阳振宇,陈盼,白雪,朱中武,孟芳,吴愈柏,唐连飞. 中国动物检疫. 2010(11)
硕士论文
[1]非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重PCR及双重荧光PCR检测方法的建立与应用[D]. 张倩.扬州大学 2010
本文编号：3575278
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3575278.html
