鸡Prox1基因重组真核表达载体的构建及其表达特征分析
发布时间：2022-01-08 21:30
Prox1 （prospero-related homeobox protein 1）作为转录因子在胚胎发育过程中起关键调控作用。为探究鸡（Gallus gallus） Prox1蛋白亚细胞定位及其在鸡生长发育中的基因表达规律,本研究以前期构建的pCR2.1-Prox1克隆载体为基础,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-Prox1,将其转染人（Homo sapien）胚胎肾细胞（HEK-293T）,通过Western blot方法检测重组蛋白的表达,利用倒置荧光显微镜观察重组蛋白的亚细胞定位;采用qRT-PCR技术检测Prox1基因在鸡胚胎期14 d （E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d） 4个时间点各组织中的表达情况。结果显示,本研究成功构建了鸡Prox1基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-Prox1,转染细胞后重组蛋白EGFP-Prox1成功表达;荧光观察显示,EGFP-Prox1重组蛋白主要定位在细胞核。qRT-PCR检测结果显示,在不同组织中,Prox1基因在鸡E14 d和7 d的胃中表达最高,0和14 d的肺脏中表达最高;在不同时间点的...
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(08)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
重组真核表达载体p EGFP-C1-Prox1双酶切鉴定
图1 重组真核表达载体p EGFP-C1-Prox1双酶切鉴定对上述鸡Prox1基因在不同发育过程的表达规律进行分析，从E14 d到14 d阶段，Prox1在眼和脑中的表达趋于稳定；7 d前，Prox1在心脏中表达稳定，之后开始显著上升，在14 d时达到最高；0 d前在肝脏中表达稳定，出壳后开始逐渐增加，在14 d时达到最高；在肺脏中，E14 d最低，14 d时最高，在发育过程中表达量随时间的增加而增加；在胃和腿肌中，均在E14 d最高、0 d最低、7 d有较高表达，整体表达趋势呈现W形态；在胸肌中，从E14 d到7 d表达增加，之后下降。
在结构上，Prox1蛋白含有homeobox和prospe‐ro结构域，其中prospero结构域可促进DNA上蛋白质的正确排列，并掩盖同源域内的核输出信号(Yousef et al.,2005)。除此之外，Prox1的N端部分具有核定位信号和2个核受体盒，可介导Prox1与肝细胞核因子4 (Song et al.,2006)、肝受体同系物1和肝受体同系物类固醇因子1等核受体相互作用(Steffensen et al.,2004)。在功能上，Prox1作为转录因子对胚胎发育过程中的器官发育至关重要。胚胎发育早期，外胚层中的Prox1在神经管、交感神经节、心肌细胞和淋巴内皮中表达(Rodriguez-Nie‐denführ et al.,2001)，是脑神经发生发育过程中齿状回颗粒细胞成熟和成体神经发生过程中维持中间祖细胞所必需(Lavado et al.,2010)。内胚层中，Prox1表达局限于产生哺乳动物胰腺和肝脏的区域，是肝细胞、胆管和胰腺上皮的标志物(Burke etal.,2002)。胚胎发育过程中Prox1的缺失，导致胚胎肝脏减小70%、胰腺减小63%、心脏减少30%且发育异常，肝叶内没有肝细胞、没有淋巴管，胚胎在早期死亡(Wigle et al.,2002;Wang et al.,2005;Rise‐bro et al.,2009)。除此之外，Prox1存在的同源结构域能结合DNA并调控其他基因的转录。如Prox1与鸡βB1晶状蛋白基因中的启动子直接相互作用以激活该基因的表达(Chen et al.,2008)。淋巴管内皮细胞中，Prox1直接结合Pdpn (podoplanin)基因的5"调控区并反式激活其表达(Pan et al.,2014)。本研究将鸡Prox1基因插入到p EGFP-C1中，构建真核表达载体p EGFP-C1-Prox1，将其转染HEK-293T细胞得到成功表达，并且重组蛋白EGFP-Prox1主要定位在细胞核。有研究发现，鸡胚胎发育4 d,Prox1蛋白在背胰芽和肝脏的细胞核表达；同样在胚胎14 d的小鼠成肝细胞核中表达(Papoutsi et al.,2007;Dudas et al.,2004)。在比目鱼(Paralichthys olivaceus)的骨骼肌中，Prox1蛋白定位于细胞核，横纹肌中Prox1缺失导致骨骼肌纤维转变缓慢(Petchey et al.,2014)；在人胚胎发育到9.5周时，Prox1蛋白在内核视网膜层分化神经元的细胞核中被鉴定。从产前发育第13周到第31周，Prox1蛋白在成人视网膜中的定位与产前发育后期相同(Markitantova et al.,2014)；袁继红等(2013)将构建的猪(Sus scrofa) p EGFP-C1-Prox1重组真核表达载体转染猪肾PK15细胞，发现Prox1蛋白同样定位于细胞核；近期，本课题组对鸡Prox1蛋白质序列进行分析，运用核定位信号在线预测软件发现，Prox1蛋白氨基端存在2个核定位信号，可能介导其细胞核定位，但是尚需进一步实验验证。
【参考文献】：
期刊论文
[1]PROX1在原发胃癌中的表达及其意义[J]. 吴文安,赵金,廖娟,杨怡萍,李勤,梁晶. 陕西医学杂志. 2018(03)
[2]鸡的胚胎发育与照蛋方法[J]. 房静. 养殖技术顾问. 2014(05)
[3]猪Prox1基因的染色体定位和亚细胞定位的研究[J]. 袁继红,龙欢,田明芳,杨在清. 畜牧兽医学报. 2013(03)
[4]Pax2和Sox2及Prox1在胚胎小鼠眼发育中的表达模式[J]. 陈裕庆,刘少峰. 国际眼科杂志. 2012(05)
[5]金鱼Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛发育中的表达分析[J]. 马冬梅,朱华平,桂建芳. 动物学研究. 2007(06)
本文编号：3577318
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(08)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
重组真核表达载体p EGFP-C1-Prox1双酶切鉴定
图1 重组真核表达载体p EGFP-C1-Prox1双酶切鉴定对上述鸡Prox1基因在不同发育过程的表达规律进行分析，从E14 d到14 d阶段，Prox1在眼和脑中的表达趋于稳定；7 d前，Prox1在心脏中表达稳定，之后开始显著上升，在14 d时达到最高；0 d前在肝脏中表达稳定，出壳后开始逐渐增加，在14 d时达到最高；在肺脏中，E14 d最低，14 d时最高，在发育过程中表达量随时间的增加而增加；在胃和腿肌中，均在E14 d最高、0 d最低、7 d有较高表达，整体表达趋势呈现W形态；在胸肌中，从E14 d到7 d表达增加，之后下降。
在结构上，Prox1蛋白含有homeobox和prospe‐ro结构域，其中prospero结构域可促进DNA上蛋白质的正确排列，并掩盖同源域内的核输出信号(Yousef et al.,2005)。除此之外，Prox1的N端部分具有核定位信号和2个核受体盒，可介导Prox1与肝细胞核因子4 (Song et al.,2006)、肝受体同系物1和肝受体同系物类固醇因子1等核受体相互作用(Steffensen et al.,2004)。在功能上，Prox1作为转录因子对胚胎发育过程中的器官发育至关重要。胚胎发育早期，外胚层中的Prox1在神经管、交感神经节、心肌细胞和淋巴内皮中表达(Rodriguez-Nie‐denführ et al.,2001)，是脑神经发生发育过程中齿状回颗粒细胞成熟和成体神经发生过程中维持中间祖细胞所必需(Lavado et al.,2010)。内胚层中，Prox1表达局限于产生哺乳动物胰腺和肝脏的区域，是肝细胞、胆管和胰腺上皮的标志物(Burke etal.,2002)。胚胎发育过程中Prox1的缺失，导致胚胎肝脏减小70%、胰腺减小63%、心脏减少30%且发育异常，肝叶内没有肝细胞、没有淋巴管，胚胎在早期死亡(Wigle et al.,2002;Wang et al.,2005;Rise‐bro et al.,2009)。除此之外，Prox1存在的同源结构域能结合DNA并调控其他基因的转录。如Prox1与鸡βB1晶状蛋白基因中的启动子直接相互作用以激活该基因的表达(Chen et al.,2008)。淋巴管内皮细胞中，Prox1直接结合Pdpn (podoplanin)基因的5"调控区并反式激活其表达(Pan et al.,2014)。本研究将鸡Prox1基因插入到p EGFP-C1中，构建真核表达载体p EGFP-C1-Prox1，将其转染HEK-293T细胞得到成功表达，并且重组蛋白EGFP-Prox1主要定位在细胞核。有研究发现，鸡胚胎发育4 d,Prox1蛋白在背胰芽和肝脏的细胞核表达；同样在胚胎14 d的小鼠成肝细胞核中表达(Papoutsi et al.,2007;Dudas et al.,2004)。在比目鱼(Paralichthys olivaceus)的骨骼肌中，Prox1蛋白定位于细胞核，横纹肌中Prox1缺失导致骨骼肌纤维转变缓慢(Petchey et al.,2014)；在人胚胎发育到9.5周时，Prox1蛋白在内核视网膜层分化神经元的细胞核中被鉴定。从产前发育第13周到第31周，Prox1蛋白在成人视网膜中的定位与产前发育后期相同(Markitantova et al.,2014)；袁继红等(2013)将构建的猪(Sus scrofa) p EGFP-C1-Prox1重组真核表达载体转染猪肾PK15细胞，发现Prox1蛋白同样定位于细胞核；近期，本课题组对鸡Prox1蛋白质序列进行分析，运用核定位信号在线预测软件发现，Prox1蛋白氨基端存在2个核定位信号，可能介导其细胞核定位，但是尚需进一步实验验证。
【参考文献】：
期刊论文
[1]PROX1在原发胃癌中的表达及其意义[J]. 吴文安,赵金,廖娟,杨怡萍,李勤,梁晶. 陕西医学杂志. 2018(03)
[2]鸡的胚胎发育与照蛋方法[J]. 房静. 养殖技术顾问. 2014(05)
[3]猪Prox1基因的染色体定位和亚细胞定位的研究[J]. 袁继红,龙欢,田明芳,杨在清. 畜牧兽医学报. 2013(03)
[4]Pax2和Sox2及Prox1在胚胎小鼠眼发育中的表达模式[J]. 陈裕庆,刘少峰. 国际眼科杂志. 2012(05)
[5]金鱼Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛发育中的表达分析[J]. 马冬梅,朱华平,桂建芳. 动物学研究. 2007(06)
本文编号：3577318
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