肠球菌属细菌素的筛选及其结构基因的表达
发布时间：2022-01-09 04:36
肠球菌属于乳酸菌,是人和动物肠道及部分食品的重要微生物菌群,它能够产生称为肠球菌素的抗菌肽。由于肠球菌产生的细菌素不仅能够抑制与其相关的菌群还能够抑制革兰氏阳性致病菌和食源致病菌,因此,它们有望应用在动物饲料添加剂和天然食品保鲜剂中。本研究拟从我室分离保存的具有益生特性的肠球菌中,进一步筛选产细菌素的细菌素菌株,并对其细菌素抑菌特性研究,为开发新型微生态制剂提供理论依据。通过对屎肠球菌HDRsEfl抑菌谱的测定确定金黄色葡萄球菌作为指示菌。琼脂覆盖试验显示,11株试验菌株中有5株菌肠球菌有明显的抑菌效果,结合PCR技术对常见的肠球菌素基因进行检测,最终筛选出两株产EnterocinL50的肠球菌分别为屎肠球菌Wsg09和粪肠球菌T-12。产细菌素肠球菌的生长曲线、pH和抑菌圈曲线显示,菌株生长迅速,产酸,培养30h时细菌素活性达到最大。从产细菌素菌株的野生质粒上成功扩增到了entL50基因,证明该细菌素是由质粒DNA编码,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上,构建克隆质粒pMD-L50测序分析,与登录号FJ618564.1的基因序列同源性达到100%。运用生物信息学方法分析了蛋白相关...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
前言
1 文献综述
1.1 细菌素的研究进展
1.1.1 细菌素的发现及定义
1.1.2 细菌素的命名及分类
1.1.3 细菌素的分子生物学特性
1.1.4 细菌素的作用机制
1.1.5 细菌素与抗生素的区别
1.1.6 细菌素的应用
1.2 主要肠球菌素的介绍
1.2.1 Class Ⅰ羊毛硫类肠球菌素—溶细胞素
1.2.2 Class Ⅱa片球菌样肠球菌素—肠球菌素A、P
1.2.3 Class Ⅱb无前导肽的肠球菌素—肠球菌素L50、Q
1.2.4 Class Ⅱc线性非片球菌素样肠球菌素—肠球菌素B
1.2.5 Class Ⅱd环状肠球菌—肠球菌素AS-48
2 本研究的目的意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 试验菌株及载体
3.1.2 主要试剂溶液的配制
3.1.3 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 屎肠球菌HDRsEf1发酵液上清抑菌谱的试验
3.2.2 肠球菌属菌体抑菌试验
3.2.3 肠球菌素基因PCR的检测
3.2.4 产细菌素菌株的表型鉴定
3.2.5 产细菌素菌株的生长动力学测定
3.2.6 细菌素基因位置的确定
3.2.7 entL50基因片段的克隆
3.2.8 重组质粒的鉴定
3.2.9 表达载体pET28a-L50A和pET28a-L50B的构建
3.2.10 表达载体pET28a-L50A和pET28a-L50B的鉴定
3.2.11 Ent.L50在大肠杆菌表达系统中的融合表达
3.2.12 原核表达融合蛋白的纯化
3.2.13 融合肠球菌素蛋白抑菌活性的研究
4 结果与分析
4.1 屎肠球菌HDRsEfl发酵液上清抑菌谱
4.2 肠球菌属菌体抑菌结果
4.3 肠球菌素分子生物学鉴定
4.3.1 肠球菌肠球菌素的基因检测
4.3.2 阳性肠球菌素基因PCR扩增及测序结果
4.3.3 产细菌素菌株抑菌表型鉴定
4.3.4 产细菌素菌株生长动力学曲线
4.4 产细菌素菌株野生质粒的提取及质粒PCR鉴定
4.5 重组质粒pMD-L50的正确构建
4.6 Ent.L50序列特征及其结构蛋白预测分析
4.6.1 Ent.L50A和B蛋白理化性质分析
4.6.2 Ent.L50A和B二级结构的模拟
4.7 重组表达载体的正确构建
4.8 重组菌诱导后生长曲线
4.9 表达产物的SDS-PAGE分析结果
4.9.1 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的表达
4.9.2 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B细胞定位
4.9.3 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的纯化
4.10 表达产物的Westen blot鉴定
4.11 表达产物抑菌活性鉴定
4.11.1 His-Ent.L50抑菌活性及MIC、MBC测定
4.11.2 His-Ent.L50抑菌谱测定
4.11.3 His-Ent.L50对常见致病菌生长的影响
5 讨论
5.1 肠球菌的抑菌作用
5.2 肠球菌素基因的PCR检测
5.3 Ent.L50基因序列特征
5.4 Ent.L50蛋白结构与其功能的关系
5.5 细菌素的异源表达
5.6 细菌素抑菌作用
结论
参考文献
致谢
本文编号：3577972
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
前言
1 文献综述
1.1 细菌素的研究进展
1.1.1 细菌素的发现及定义
1.1.2 细菌素的命名及分类
1.1.3 细菌素的分子生物学特性
1.1.4 细菌素的作用机制
1.1.5 细菌素与抗生素的区别
1.1.6 细菌素的应用
1.2 主要肠球菌素的介绍
1.2.1 Class Ⅰ羊毛硫类肠球菌素—溶细胞素
1.2.2 Class Ⅱa片球菌样肠球菌素—肠球菌素A、P
1.2.3 Class Ⅱb无前导肽的肠球菌素—肠球菌素L50、Q
1.2.4 Class Ⅱc线性非片球菌素样肠球菌素—肠球菌素B
1.2.5 Class Ⅱd环状肠球菌—肠球菌素AS-48
2 本研究的目的意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 试验菌株及载体
3.1.2 主要试剂溶液的配制
3.1.3 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 屎肠球菌HDRsEf1发酵液上清抑菌谱的试验
3.2.2 肠球菌属菌体抑菌试验
3.2.3 肠球菌素基因PCR的检测
3.2.4 产细菌素菌株的表型鉴定
3.2.5 产细菌素菌株的生长动力学测定
3.2.6 细菌素基因位置的确定
3.2.7 entL50基因片段的克隆
3.2.8 重组质粒的鉴定
3.2.9 表达载体pET28a-L50A和pET28a-L50B的构建
3.2.10 表达载体pET28a-L50A和pET28a-L50B的鉴定
3.2.11 Ent.L50在大肠杆菌表达系统中的融合表达
3.2.12 原核表达融合蛋白的纯化
3.2.13 融合肠球菌素蛋白抑菌活性的研究
4 结果与分析
4.1 屎肠球菌HDRsEfl发酵液上清抑菌谱
4.2 肠球菌属菌体抑菌结果
4.3 肠球菌素分子生物学鉴定
4.3.1 肠球菌肠球菌素的基因检测
4.3.2 阳性肠球菌素基因PCR扩增及测序结果
4.3.3 产细菌素菌株抑菌表型鉴定
4.3.4 产细菌素菌株生长动力学曲线
4.4 产细菌素菌株野生质粒的提取及质粒PCR鉴定
4.5 重组质粒pMD-L50的正确构建
4.6 Ent.L50序列特征及其结构蛋白预测分析
4.6.1 Ent.L50A和B蛋白理化性质分析
4.6.2 Ent.L50A和B二级结构的模拟
4.7 重组表达载体的正确构建
4.8 重组菌诱导后生长曲线
4.9 表达产物的SDS-PAGE分析结果
4.9.1 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的表达
4.9.2 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B细胞定位
4.9.3 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的纯化
4.10 表达产物的Westen blot鉴定
4.11 表达产物抑菌活性鉴定
4.11.1 His-Ent.L50抑菌活性及MIC、MBC测定
4.11.2 His-Ent.L50抑菌谱测定
4.11.3 His-Ent.L50对常见致病菌生长的影响
5 讨论
5.1 肠球菌的抑菌作用
5.2 肠球菌素基因的PCR检测
5.3 Ent.L50基因序列特征
5.4 Ent.L50蛋白结构与其功能的关系
5.5 细菌素的异源表达
5.6 细菌素抑菌作用
结论
参考文献
致谢
本文编号：3577972
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