建立Td-tomato标记KRT18基因的牛胎儿成纤维细胞系及用于iPS诱导的初步研究
发布时间：2022-01-11 20:07
上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）是上皮样细胞向间充质样细胞转变的过程,是一个中间态的变化,现已被证明在癌症发生、组织愈合以及iPS诱导过程中起着十分重要的作用。在iPS诱导过程中,主要发生的是EMT的逆过程,即成纤维样细胞-上皮样细胞的转化（MET）,在这一过程中,会逐渐失去成纤维的细胞形态,转变为连接更为紧密的上皮细胞形态,且能表达简单上皮细胞的特异性标志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作为中间丝蛋白中的简单上皮蛋白,在癌症和早期胚胎发育与着床以及iPS诱导过程MET发生中起着标志性的作用,因此研究这一基因在胚胎发育与iPS诱导中的作用,对其在基础功能上的研究具有重要意义。本研究以实验室前期构建的pKlrkt打靶载体为基础载体,分别用PCR的方法从胎牛成纤维细胞基因组中获得包含有该基因启动区的5`同源臂和3`同源臂,以酶切连接的方法将两个同源臂连在基础载体的MluI和NheI两个位点,再对td-Tomato质粒进行BamHI和NotI双酶切,回收片段与连接好两个同源臂的pKlrkta载体进行连接,获得内含...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EMT相关信号通路，引自DongreA,WeinbergRA[1]
4.1 pTKlrkt 打靶载体构建通过已经设计好的引物，以及适宜的PCR条件下，我们获得了与预期一致的1240 bp的5`arm，和946 bp的3`arm，如图1。将这一对同源臂连到pEASY-T1 Cloning vector上，鉴定并测序，Blast结果显示5`arm和3`arm与GeneBank提供的KRT18序列同源性达到99%，显示得到了连接正确的PT-5a和PT-3a两种质粒图1 同源臂扩增结果 A：5`arm扩增结果；B：3`arm扩增结果（M：1Kb Plus Marker）Figure 1 The amplification results of homology arms A:The PCR results of 5`arm; B: The PCR results of 3`arm（M：1Kb Plus Marker）pTKlrkt打靶载体构建完成后，分别用双酶切或单酶切以鉴定已连接到pTKlrkt打靶载体中的5`arm、3`arm以及td-Tomato片段的大小及方向。鉴定3`arm时，分别用EcoNI单酶切、BglII和Sfiz双酶切，电泳后显示前者酶切片段大小为633bp、4222bp 和5875bp，后者片段大小为1990 bp和5867 bp
连接到pTKlrkt打靶载体中。通过对以上三个外源片段的酶切验证，我们确定pTKlrkt打靶载体连接成功，并使用DNAMAN绘制质粒图谱，如图3。图23`arm 、5`arm和td-Tomato酶切鉴定结果 A、B：3`arm鉴定结果；C：5`arm鉴定结果；D：td-Tomat鉴定结果（M：1Kb Plus Marker）Figure 2 The restriction enzyme digestion results of 3`arm、5`arm and td-Tomato A、B：Identification resultsof 3`arm; C：The results of 5`arm tests; D：Identification result of td-Tomato (M：1Kb Plus Marker)
本文编号：3583384
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EMT相关信号通路，引自DongreA,WeinbergRA[1]
4.1 pTKlrkt 打靶载体构建通过已经设计好的引物，以及适宜的PCR条件下，我们获得了与预期一致的1240 bp的5`arm，和946 bp的3`arm，如图1。将这一对同源臂连到pEASY-T1 Cloning vector上，鉴定并测序，Blast结果显示5`arm和3`arm与GeneBank提供的KRT18序列同源性达到99%，显示得到了连接正确的PT-5a和PT-3a两种质粒图1 同源臂扩增结果 A：5`arm扩增结果；B：3`arm扩增结果（M：1Kb Plus Marker）Figure 1 The amplification results of homology arms A:The PCR results of 5`arm; B: The PCR results of 3`arm（M：1Kb Plus Marker）pTKlrkt打靶载体构建完成后，分别用双酶切或单酶切以鉴定已连接到pTKlrkt打靶载体中的5`arm、3`arm以及td-Tomato片段的大小及方向。鉴定3`arm时，分别用EcoNI单酶切、BglII和Sfiz双酶切，电泳后显示前者酶切片段大小为633bp、4222bp 和5875bp，后者片段大小为1990 bp和5867 bp
连接到pTKlrkt打靶载体中。通过对以上三个外源片段的酶切验证，我们确定pTKlrkt打靶载体连接成功，并使用DNAMAN绘制质粒图谱，如图3。图23`arm 、5`arm和td-Tomato酶切鉴定结果 A、B：3`arm鉴定结果；C：5`arm鉴定结果；D：td-Tomat鉴定结果（M：1Kb Plus Marker）Figure 2 The restriction enzyme digestion results of 3`arm、5`arm and td-Tomato A、B：Identification resultsof 3`arm; C：The results of 5`arm tests; D：Identification result of td-Tomato (M：1Kb Plus Marker)
本文编号：3583384
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