鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定
发布时间：2022-01-13 07:53
鸡球虫病是由多种艾美尔球虫引起的具有严重危害的寄生虫病,其中以柔嫩艾美尔球虫（Eimeria tenella）致病力最强,每年给养鸡业造成巨大经济损失。对球虫进行防控,最有效的方法是阻断其入侵,所以筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质是阐明球虫致病机理从而进行有效防控的首要任务。球虫入侵过程复杂,许多蛋白质如棒状体蛋白、微线蛋白和表面抗原蛋白等已被证明与球虫入侵相关。有研究表明分泌蛋白在球虫入侵过程中可能发挥重要作用,对入侵相关分泌蛋白进行研究将有助于筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质,加深对球虫入侵机理和球虫-宿主之间互作机制的了解,并为制备更有效的抗球虫药物或疫苗提供更多重要参考数据。本研究通过TMT标记定量蛋白质组学技术对E.tenella体外入侵DF1细胞的相关分泌蛋白进行了系统筛选鉴定,并对2个E.tenella入侵相关蛋白质SAG14和EF1α进行了功能初步分析。本研究主要分为以下四个部分:1.柔嫩艾美尔球虫体外入侵DF1细胞分泌蛋白质组学分析为对球虫入侵机理及球虫-宿主细胞之间互作机制进行深入研究,筛选鉴定入侵相关蛋白质成为研究重点。本研究以未感染细胞的子孢子分泌蛋白为对照,通过TMT标记...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
试验设计流程图
山东农业大学硕士学位论文13图2TMT标记定蛋白质组学技术路线Fig.2TMTMarkingProteomicsTechnologyRoute2.2.5.2胰酶酶解（1）向分泌蛋白溶液中加入终浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇，56℃还原30min；（2）加入终浓度为11mmol/L的碘代乙酰胺，避光室温孵育15min；（3）将样品的尿素浓度稀释至低于2mol/L，按照1:50质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，37℃过夜酶解；（4）以1:100的质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，继续酶解4h2.2.5.3TMT标记胰酶酶解的肽段用StrataXC18（Phenomenex）除盐后进行真空冷冻干燥。以0.5mol/LTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。2.2.5.4HPLC分级肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300ExtendC18（5μm粒径，4.6mm内径，250mm长）。操作如下：肽段分级梯度为8%~32%乙腈、pH9，1h时间分离60个组分，随后肽段合并为6个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。2.2.5.5液相色谱-质谱联用分析肽段用液相色谱流动相A相（0.1%(v/v)甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC1000
鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定26孢子，接种DF1细胞，37℃，5%CO2细胞培养箱培养12h；（6）收集培养上清及2次PBS洗涤液，1500r/min离心5min，弃上清，加入PBS重悬子孢子并进行精确计数，统计分析蛋白免疫抑制子孢子入侵DF1细胞效率2.2.18动物免疫保护性试验2.2.18.1动物试验设计及免疫程序购买150只1日龄海蓝褐公雏鸡，饲喂于隔离罩中。第一次免疫前称重，剔除体重差异较大雏鸡，剩余雏鸡随机分为4组，每组30只。4个组分别标号为：PBS-I组（不免疫不感染组），PBS-II组（不免疫感染组），SAG14蛋白免疫组和EF1α蛋白免疫组（表6）。雏鸡第7和14日龄时，分别将PBS和纯化蛋白与弗氏佐剂乳化液对雏鸡颈部皮下多点注射进行初次免疫与二次免疫。雏鸡21日龄时，除PBS-I组外均经口接种1×104个新鲜孢子化卵囊。分别在雏鸡21和31日龄时称量体重，26日龄时每组随机抓取5只雏鸡，观察盲肠病变并评定记分，在雏鸡21和26日龄时每组随机挑选3只雏鸡采血分离血清，收集雏鸡26至31日龄粪便统计卵囊排出量（图3）。表6动物实验分组Table6AnimalExperimentGrouping组别PBS-IPBS-IISAG14蛋白组EF1α蛋白组Numberofbirds30303030Proteins(μg/bird)PBSPBS5050Infection(E.tenella)-+++图3动物试验设计流程图Fig.3Animalexperimentdesignflowchart
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于iTRAQ技术分析柔嫩艾美耳球虫感染后CEF细胞的差异表达蛋白[J]. 王璐,朱顺海,赵其平,黄兵,韩红玉,刘桂玲,李志行,赵焕之,董辉. 中国动物传染病学报. 2020(05)
[2]柔嫩艾美耳球虫侵入相关抗原研究进展[J]. 郭衍冰,曹利利,姚新华,董航,程荣华,苑淑贤. 畜牧与兽医. 2016(08)
[3]柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达[J]. 曹利利,姚新华,郭衍冰,王英贺,任科研,魏峰,苑淑贤. 动物医学进展. 2015(09)
[4]柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达[J]. 王晔,姜连连,韩红玉,薛璞,赵其平,董辉,朱顺海,舒凡帆,黄兵. 中国动物传染病学报. 2012(05)
[5]柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG7基因的克隆与表达[J]. 李红炳. 云南畜牧兽医. 2011(06)
[6]真核细胞非经典蛋白分泌途径[J]. 张楠楠,刘欣,孙晶,吴毓,李庆伟. 遗传. 2009(01)
[7]鸡球虫入侵机理、免疫学性质及基因工程在疫苗研制上的应用[J]. 陈静,丁宏标,乔宇,韩德强. 生物技术通报. 2007(06)
[8]鸡球虫入侵相关分子的研究进展[J]. 韩红玉,林矫矫,黄兵. 动物医学进展. 2007(09)
[9]翻译延伸因子1A的研究进展[J]. 周冰,曹诚,刘传暄. 生物技术通讯. 2007(02)
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫外泌体的分离与鉴定及泛素蛋白功能初步研究[D]. 李志行.上海师范大学 2019
[2]鸡柔嫩艾美耳球虫RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆与原核表达[D]. 许李丽.西南大学 2013
[3]柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag13和sag14的克隆与原核表达研究[D]. 陈静.中国农业科学院 2008
[4]柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG21和SAG23的免疫原性研究[D]. 廖玉声.南京农业大学 2008
[5]鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG5和SAG10基因的克隆与表达及免疫保护性试验[D]. 麦博.西北农林科技大学 2007
本文编号：3586023
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
试验设计流程图
山东农业大学硕士学位论文13图2TMT标记定蛋白质组学技术路线Fig.2TMTMarkingProteomicsTechnologyRoute2.2.5.2胰酶酶解（1）向分泌蛋白溶液中加入终浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇，56℃还原30min；（2）加入终浓度为11mmol/L的碘代乙酰胺，避光室温孵育15min；（3）将样品的尿素浓度稀释至低于2mol/L，按照1:50质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，37℃过夜酶解；（4）以1:100的质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，继续酶解4h2.2.5.3TMT标记胰酶酶解的肽段用StrataXC18（Phenomenex）除盐后进行真空冷冻干燥。以0.5mol/LTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。2.2.5.4HPLC分级肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300ExtendC18（5μm粒径，4.6mm内径，250mm长）。操作如下：肽段分级梯度为8%~32%乙腈、pH9，1h时间分离60个组分，随后肽段合并为6个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。2.2.5.5液相色谱-质谱联用分析肽段用液相色谱流动相A相（0.1%(v/v)甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC1000
鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定26孢子，接种DF1细胞，37℃，5%CO2细胞培养箱培养12h；（6）收集培养上清及2次PBS洗涤液，1500r/min离心5min，弃上清，加入PBS重悬子孢子并进行精确计数，统计分析蛋白免疫抑制子孢子入侵DF1细胞效率2.2.18动物免疫保护性试验2.2.18.1动物试验设计及免疫程序购买150只1日龄海蓝褐公雏鸡，饲喂于隔离罩中。第一次免疫前称重，剔除体重差异较大雏鸡，剩余雏鸡随机分为4组，每组30只。4个组分别标号为：PBS-I组（不免疫不感染组），PBS-II组（不免疫感染组），SAG14蛋白免疫组和EF1α蛋白免疫组（表6）。雏鸡第7和14日龄时，分别将PBS和纯化蛋白与弗氏佐剂乳化液对雏鸡颈部皮下多点注射进行初次免疫与二次免疫。雏鸡21日龄时，除PBS-I组外均经口接种1×104个新鲜孢子化卵囊。分别在雏鸡21和31日龄时称量体重，26日龄时每组随机抓取5只雏鸡，观察盲肠病变并评定记分，在雏鸡21和26日龄时每组随机挑选3只雏鸡采血分离血清，收集雏鸡26至31日龄粪便统计卵囊排出量（图3）。表6动物实验分组Table6AnimalExperimentGrouping组别PBS-IPBS-IISAG14蛋白组EF1α蛋白组Numberofbirds30303030Proteins(μg/bird)PBSPBS5050Infection(E.tenella)-+++图3动物试验设计流程图Fig.3Animalexperimentdesignflowchart
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于iTRAQ技术分析柔嫩艾美耳球虫感染后CEF细胞的差异表达蛋白[J]. 王璐,朱顺海,赵其平,黄兵,韩红玉,刘桂玲,李志行,赵焕之,董辉. 中国动物传染病学报. 2020(05)
[2]柔嫩艾美耳球虫侵入相关抗原研究进展[J]. 郭衍冰,曹利利,姚新华,董航,程荣华,苑淑贤. 畜牧与兽医. 2016(08)
[3]柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达[J]. 曹利利,姚新华,郭衍冰,王英贺,任科研,魏峰,苑淑贤. 动物医学进展. 2015(09)
[4]柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达[J]. 王晔,姜连连,韩红玉,薛璞,赵其平,董辉,朱顺海,舒凡帆,黄兵. 中国动物传染病学报. 2012(05)
[5]柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG7基因的克隆与表达[J]. 李红炳. 云南畜牧兽医. 2011(06)
[6]真核细胞非经典蛋白分泌途径[J]. 张楠楠,刘欣,孙晶,吴毓,李庆伟. 遗传. 2009(01)
[7]鸡球虫入侵机理、免疫学性质及基因工程在疫苗研制上的应用[J]. 陈静,丁宏标,乔宇,韩德强. 生物技术通报. 2007(06)
[8]鸡球虫入侵相关分子的研究进展[J]. 韩红玉,林矫矫,黄兵. 动物医学进展. 2007(09)
[9]翻译延伸因子1A的研究进展[J]. 周冰,曹诚,刘传暄. 生物技术通讯. 2007(02)
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫外泌体的分离与鉴定及泛素蛋白功能初步研究[D]. 李志行.上海师范大学 2019
[2]鸡柔嫩艾美耳球虫RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆与原核表达[D]. 许李丽.西南大学 2013
[3]柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag13和sag14的克隆与原核表达研究[D]. 陈静.中国农业科学院 2008
[4]柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG21和SAG23的免疫原性研究[D]. 廖玉声.南京农业大学 2008
[5]鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG5和SAG10基因的克隆与表达及免疫保护性试验[D]. 麦博.西北农林科技大学 2007
本文编号：3586023
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