甲基化转移酶抑制剂对克隆猪胚胎早期发育的影响及克隆猪隐睾的研究

发布时间：2022-01-14 06:27

　　首例体细胞核移植克隆猪虽已诞生多年,但核移植效率仍然很低。体细胞核移植多采用体外成熟的MⅡ期卵母细胞去核后作为受体卵。但由于猪卵母细胞体外成熟体系还不够完善,所以仍需进一步优化。同时,重构胚胎的不完全重编程会导致附植前胚胎不能正常发育。即使极少数胚胎能够发育存活并诞下后代,后代也常伴有不同程度的发育缺陷或表型异常。相比着床前的胚胎和克隆动物胎儿,目前对表型异常的克隆猪的甲基化模式研究仍然较少,其分子生物学机制仍不清楚。本文拟通过在卵母细胞成熟液中添加红景天多糖（rhodiola sachalinensis polysaccaride,RSP）来获得高质量的体外成熟卵母细胞,同时尝试应用新型甲基化转移酶抑制剂RG108来纠正附植前胚胎的异常甲基化修饰状态,以提高核移植效率。本实验室在随后的克隆猪的生产中一共诞下了4头克隆猪,其中一头出生后不久死亡,另有2头克隆猪发生隐睾。针对这两头隐睾克隆猪,我们研究了其睾丸发育相关基因表达及其甲基化的变化。主要研究结果如下：（1）在猪卵母细胞成熟液中添加0.6、6和60mg·L-1的RSP,以第一极体作为核成熟的标志,计算卵母细胞核成熟率；统计体外受精... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
第一部分 文献综述
    第一章 猪体细胞核移植研究进展
        1.1 体细胞核移植研究进展
        1.2 克隆猪的研究进展
            1.2.1 猪体细胞核移植的主要影响因素
            1.2.2 体细胞核移植的应用前景
    第二章 体细胞核移植与表观遗传学修饰
        2.1 DNA甲基化
        2.2 组蛋白乙酰化
        2.3 基因组印记
        2.4 X染色体失活
    第三章 DNA甲基化生物学功能及甲基化检测方法
        3.1 DNA甲基化生物学功能
            3.1.1 DNA甲基化与基因表达
            3.1.2 DNA甲基化与胚胎发育
            3.1.3 DNA甲基化与X染色体失活
            3.1.4 DNA甲基化与基因印记
            3.1.5 DNA甲基化与肿瘤
            3.1.6 DNA甲基化的其他生物学功能
            3.1.7 DNA甲基化转移酶抑制剂抑制干预DNA甲基化
        3.2 DNA甲基化的检测方法
第二部分 试验部分
    第四章 红景天多糖对猪卵母细胞体外成熟的影响
        4.1 材料与方法
            4.1.1 材料
            4.1.2 方法
        4.2 结果与分析
            4.2.1 成熟液中添加RSP对核成熟率的影响
            4.2.2 成熟液中添加RSP对成熟卵母细胞中GSH浓度和ROS水平的影响
            4.2.3 成熟液中添加RSP对体外受精后胚胎发育的影响
            4.2.4 成熟液中添加RSP对体细胞核移植胚胎发育的影响
        4.3 讨论
        4.4 本章小结
    第五章 甲基化转移酶抑制剂对供体细胞的影响
        5.1 材料与方法
            5.1.1 材料
            5.1.2 方法
        5.2 结果
            5.2.1 HPLC检测RG108对PFF基因组DNA甲基化水平的影响
            5.2.2 RG108处理对PFF印记基因甲基化水平的影响
            5.2.3 RG108处理PFF对细胞生长和细胞凋亡的影响
            5.2.4 RG108处理PFF对细胞染色体数的影响
        5.3 讨论
        5.4 本章小结
    第六章 甲基化转移酶抑制剂核移植胚胎发育的影响
        6.1 材料与方法
            6.1.1 材料
            6.1.2 方法
        6.2 结果与分析
            6.2.1 RG108处理供体细胞对核移植效率的影响
            6.2.2 RG108处理早期重构胚对核移植效率的影响
            6.2.3 RG108同时处理供体细胞与重构胚胎对核移植效率的影响
            6.2.4 免疫荧光染色检测囊胚DNA甲基化水平
        6.3 讨论
        6.4 本章小结
    第七章 SOX9和INSL3基因在克隆猪隐睾中的表达及甲基化模式
        7.1 材料与方法
            7.1.1 材料
            7.1.2 方法
        7.2 结果
            7.2.1 重构胚胎的移植
            7.2.2 睾丸组织切片显微结构
            7.2.3 SOX9和INSL3基因的表达
            7.2.4 SOX9和INSL3基因的启动子区域甲基化模式
        7.3 讨论
        7.4 本章小结
结论
创新性
参考文献
致谢
附录(一)
附录(二)
附录(三)
攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3587991