利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗
发布时间：2022-01-15 18:26
伪狂犬病毒是α-疱疹病毒属成员,基因组由150kb左右的DNA双链构成。伪狂犬病毒感染猪只后会诱发宿主严重的传染性疾病,给全世界生猪养殖产业带来了巨大经济损失。虽然长期以来伪狂犬病毒疫苗得到了广泛应用并很好地控制了该病的流行,但近年来伪狂犬病突然在我国经过疫苗免疫的猪场爆发并在全国范围内流行,成为目前我国生猪养殖业面临的最大危害之一,这表明传统疫苗失去了对伪狂犬病的免疫保护作用,更多研究报道也进一步说明该病毒的基因组或主要抗原基因已经发生变异。传统制备伪狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多个毒力基因,并经过共几十轮的低熔点琼脂糖空斑纯化,耗时耗力。因此亟需更高效经济的病毒疫苗制备策略来应对变异毒株的爆发和流行等问题。本课题构建了基于CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑系统的快速制备伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗的新方法,同步敲除伪狂犬病毒变异毒株PRV-HNX的TK和gE两个毒力基因,成功制备了伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗侯选株,对当下流行的伪狂犬病有较好的免疫保护作用。主要步骤概括如下:1,利用CRISPR/Cas9和同源重组修复机制同时将绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation）
第一章 文献综述
1.1 伪狂犬病毒
1.1.1 伪狂犬病毒的分子生物学及危害
1.1.2 伪狂犬病毒疫苗
1.1.3 目前伪狂犬病毒在我国流行趋势
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统
1.2.1 CRISPR的发现和Cas家族的分型
1.2.2 CRISPR/Cas9系统的原理和应用
1.3 Cre/lox重组系统的特性及应用
第二章 研究目的及意义
第三章 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 病毒和细胞
3.1.2 实验动物
3.1.3 主要酶和试剂
3.1.4 载体与质粒
3.1.5 培养基与抗生素及其制备
3.1.6 主要缓冲液、试剂及其制备
3.1.7 感受态细胞制备试剂
3.1.8 低熔点琼脂糖噬斑实验试剂制备
3.2 方法
3.2.1 限制性内切酶反应
3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.4 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
3.2.5 转化连接产物或质粒载体
3.2.6 质粒载体的构建和鉴定
3.2.6.1 guide RNA的设计和表达载体构建和鉴定
3.2.6.2 体外扩增伪狂犬病毒gE和TK基因上下游同源臂
3.2.7 碱裂解法小量抽提质粒
3.2.8 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
3.2.9 引物的设计合成
3.2.10 PRN-HNX重组毒的鉴定
3.2.11 细胞培养
3.2.12 细胞PEI转染
3.2.13 低熔点琼脂糖挑斑纯化
3.2.14 病毒的增殖、收获和保存
3.2.15 病毒基因组DNA提取
3.2.16 测定病毒半数组织感染量（TCID50）
3.2.17 小鼠动物实验
3.2.18 仔猪动物实验
第四章 结果与分析
4.1 质粒载体的构建和鉴定
4.1.1 guide RNA的设计和表达载体构建和鉴定
4.1.2 TK、gE基因重组同源臂构建
4.2 利用CRISPR/Cas9系统构建PRV-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒
4.3 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒的纯化
4.3.1 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒的单细胞流式分选纯化
4.3.2 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组病毒的低熔点琼脂糖噬斑纯化
4.4 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组病毒的鉴定
4.5 利用Cre/lox系统敲除PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP荧光基因
4.6 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE的纯化和鉴定
4.7 小鼠动物实验
4.7.1 小鼠攻毒实验
4.7.2 小鼠免疫实验
4.8 仔猪动物实验
4.9 讨论
4.9.1 sgRNA的设计
4.9.2 同源重组片段的设计、扩增和融合
4.9.3 细胞转染和病毒感染条件的摸索
4.9.4 伪狂犬病毒TK基因抑制剂BVDU的使用
4.9.5 单细胞流式分选在重组病毒分选中的应用
4.9.6 CRISPR/Cas9编辑病毒基因组
4.9.7 病毒传染性疾病的防治和病毒的变异进化
4.9.8 CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑系统在疫苗制备中的潜力
4.9.9 PRV基因缺失毒株的应用
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病不同佐剂灭活疫苗对兔免疫原性初探[J]. 舒银辉,黄文辉,饶清宜,郑良益,漆世华,王桂桂,吴玉石,祝春花,杨思谊,杨雷. 中国兽药杂志. 2011(12)
[2]猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J]. 杨毅,李文刚,饶宝,张永涛,吕玉金. 江西农业学报. 2010(03)
[3]伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ+突变株的构建[J]. 陈焕春,周复春,方六荣,何启盖,吴斌,洪文洲. 病毒学报. 2001(01)
[4]伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建[J]. 颜其贵,郭万柱,余光开,王琴,娄高明. 畜牧兽医学报. 1997(06)
本文编号：3591108
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation）
第一章 文献综述
1.1 伪狂犬病毒
1.1.1 伪狂犬病毒的分子生物学及危害
1.1.2 伪狂犬病毒疫苗
1.1.3 目前伪狂犬病毒在我国流行趋势
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统
1.2.1 CRISPR的发现和Cas家族的分型
1.2.2 CRISPR/Cas9系统的原理和应用
1.3 Cre/lox重组系统的特性及应用
第二章 研究目的及意义
第三章 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 病毒和细胞
3.1.2 实验动物
3.1.3 主要酶和试剂
3.1.4 载体与质粒
3.1.5 培养基与抗生素及其制备
3.1.6 主要缓冲液、试剂及其制备
3.1.7 感受态细胞制备试剂
3.1.8 低熔点琼脂糖噬斑实验试剂制备
3.2 方法
3.2.1 限制性内切酶反应
3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.4 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
3.2.5 转化连接产物或质粒载体
3.2.6 质粒载体的构建和鉴定
3.2.6.1 guide RNA的设计和表达载体构建和鉴定
3.2.6.2 体外扩增伪狂犬病毒gE和TK基因上下游同源臂
3.2.7 碱裂解法小量抽提质粒
3.2.8 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
3.2.9 引物的设计合成
3.2.10 PRN-HNX重组毒的鉴定
3.2.11 细胞培养
3.2.12 细胞PEI转染
3.2.13 低熔点琼脂糖挑斑纯化
3.2.14 病毒的增殖、收获和保存
3.2.15 病毒基因组DNA提取
3.2.16 测定病毒半数组织感染量（TCID50）
3.2.17 小鼠动物实验
3.2.18 仔猪动物实验
第四章 结果与分析
4.1 质粒载体的构建和鉴定
4.1.1 guide RNA的设计和表达载体构建和鉴定
4.1.2 TK、gE基因重组同源臂构建
4.2 利用CRISPR/Cas9系统构建PRV-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒
4.3 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒的纯化
4.3.1 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组毒的单细胞流式分选纯化
4.3.2 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组病毒的低熔点琼脂糖噬斑纯化
4.4 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重组病毒的鉴定
4.5 利用Cre/lox系统敲除PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP荧光基因
4.6 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE的纯化和鉴定
4.7 小鼠动物实验
4.7.1 小鼠攻毒实验
4.7.2 小鼠免疫实验
4.8 仔猪动物实验
4.9 讨论
4.9.1 sgRNA的设计
4.9.2 同源重组片段的设计、扩增和融合
4.9.3 细胞转染和病毒感染条件的摸索
4.9.4 伪狂犬病毒TK基因抑制剂BVDU的使用
4.9.5 单细胞流式分选在重组病毒分选中的应用
4.9.6 CRISPR/Cas9编辑病毒基因组
4.9.7 病毒传染性疾病的防治和病毒的变异进化
4.9.8 CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑系统在疫苗制备中的潜力
4.9.9 PRV基因缺失毒株的应用
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病不同佐剂灭活疫苗对兔免疫原性初探[J]. 舒银辉,黄文辉,饶清宜,郑良益,漆世华,王桂桂,吴玉石,祝春花,杨思谊,杨雷. 中国兽药杂志. 2011(12)
[2]猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J]. 杨毅,李文刚,饶宝,张永涛,吕玉金. 江西农业学报. 2010(03)
[3]伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ+突变株的构建[J]. 陈焕春,周复春,方六荣,何启盖,吴斌,洪文洲. 病毒学报. 2001(01)
[4]伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建[J]. 颜其贵,郭万柱,余光开,王琴,娄高明. 畜牧兽医学报. 1997(06)
本文编号：3591108
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