CR4介导牛溶血性曼氏杆菌LKT诱导细胞毒性作用

发布时间：2017-05-12 11:02

  本文关键词：CR4介导牛溶血性曼氏杆菌LKT诱导细胞毒性作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)是牛呼吸道疾病综合症(Bovine respiratory disease complex,BRDC)中重要的细菌性病原之一,引起牛、羊等反刍动物的上呼吸道感染、支气管肺炎及纤维素性肺炎。在疾病的发生过程中白细胞毒素(Leukotoxin,LKT)是溶血性曼氏杆菌最重要的毒力因子之一,能够识别白细胞表面的特异性受体,引起细胞凋亡和细胞溶解。已证实的受体有β2整合素成员LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)。也有研究表明β2整合素成员CR4(CD11c/CD18)是羊感染溶血性曼氏杆菌过程中的白细胞受体,但在牛感染溶血性曼氏杆菌过程中是否也是其LKT的特异性受体呢?本研究在牛源溶血性曼氏杆菌LKT生物学特性研究的基础上,扩增牛源单核细胞CD11c和CD18的基因序列,并开展了LKT与CR4之间的研究,为进一步深入研究溶血性曼氏杆菌致病机制提供了参考。研究内容如下:首先,应用MTT法比较分析了粗提和纯化的LKT对牛外周血中性粒细胞增殖的影响,检测毒素活性。随后,根据GeneBank上公布的牛源CD18基因序列(M81233.1)设计CD18引物,参考羊(FJ601824.1)及水牛(XM_006070380.1)的CD11c基因序列,分段设计2对CD11c引物。以提取的单核细胞总RNA为模板,PCR扩增本地黄牛、荷斯坦奶牛的CD18和CD11c基因。CD18基因克隆至T载体,再EcoR I和Xba I双酶切连接至pCI-neo真核表达载体,构建真核表达质粒pCI-neo-CD18。通过Hind III和Xho I双酶切连接至pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD11c。并对奶牛CD11c进行信号肽、跨膜区和蛋白结构预测。建立瞬时表达奶牛CD18、CD11c和CR4(CD11c/CD18)的293T细胞系,采用间接免疫荧光、RT-PCR和Western Blot等方法验证奶牛CD18、CD11c和CR4蛋白的表达情况。最后,用纯化的LKT感染表达CD18、CD11c和CR4蛋白的293T细胞系,MTT检测细胞毒性,以293T细胞作为阴性对照。结果表明:纯化的LKT分子量大约100 kD左右。构建真核表达质粒pCI-neo-CD18,测得CD18序列全长2310 bp,编码758个氨基酸,奶牛、黄牛的CD18基因与GeneBank上公布的序列同源性分别为100%和96.1%。构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD11c,测得CD11c序列全长3477 bp,编码1158个氨基酸。奶牛和黄牛与GeneBank上公布的水牛、羊CD11c基因的核甘酸序列同源性分别为97.5%、95.5%和97.2%、95.2%。预测的奶牛CD11c蛋白N-末端前19个氨基酸残基为信号肽,是一次性跨膜蛋白。转染奶牛CD11c、CD18和共转染CR4(CD11c/CD18)至293T细胞后,间接免疫荧光,RT-PCR,Western Blot结果证实了CD11c、CD18和CR4蛋白均可在所构建的293T细胞系表达。MTT方法证明LKT诱导转染CR4的293T细胞毒性,证明CR4是LKT诱导细胞溶解的特异性受体。总之,研究证明了荷斯坦奶牛和本地黄牛外周血单核细胞表面具有CR4(CD11c/CD18)受体;首次获得奶牛CD11c核苷酸序列,序列长3477 bp,编码1159个氨基酸。初步探讨了荷斯坦奶牛单核细胞CR4是介导溶血性曼氏杆菌白细胞毒素LKT诱导细胞毒性作用的受体。为今后研究能够阻断毒力因子LKT与白细胞受体相互作用的药物及疫苗提供理论依据。
【关键词】：牛 溶血性曼氏杆菌 白细胞毒素 CD11c CD18 CR4
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-26
• 1.1 溶血性曼氏杆菌感染概述12-13
• 1.1.1 溶血性曼氏杆菌生物学特性12-13
• 1.1.2 临床症状13
• 1.2 溶血性曼氏杆菌的毒力因子13-20
• 1.2.1 粘附素13-14
• 1.2.2 脂多糖14-15
• 1.2.3 荚膜15-16
• 1.2.4 外膜蛋白16
• 1.2.5 蛋白酶16-17
• 1.2.6 白细胞毒素（LKT）17-20
• 1.3 β2 整合素受体研究进展20-24
• 1.3.1 β2 整合素的组成、分布和结构20-22
• 1.3.2 整合素LFA 1（CD11a/CD18;αLβ2）22-23
• 1.3.3 整合素Mac 1（CD11b/CD18；αMβ2；Mo 1）23
• 1.3.4 整合素CR4（CD11c/CD18；p150，95；αXβ2）23-24
• 1.4 研究目的和意义24-26
• 第二章 溶血性曼氏杆菌白细胞毒素（LKT）的提取及其活性研究26-34
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 细菌菌株26
• 2.1.2 主要生化试剂26
• 2.1.3 主要仪器设备及来源26-27
• 2.2 方法27-29
• 2.2.1 细菌的复苏培养27
• 2.2.2 主要生物学特性检测27
• 2.2.3 白细胞毒素制备27
• 2.2.4 超滤浓缩27
• 2.2.5 SDS PAGE27-28
• 2.2.6 白细胞毒素活性的测定28-29
• 2.3 结果29-31
• 2.3.1 细菌培养特性及生化试验结果29-30
• 2.3.2 SDS PAGE结果30
• 2.3.3 白细胞毒素活性检测结果30-31
• 2.4 讨论与小结31-34
• 第三章 β2 整合素CD11c和CD18的克隆及真核表达质粒的构建34-56
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 细菌菌株和质粒载体34
• 3.1.2 工具酶与主要生化试剂34
• 3.1.3 试剂盒及其他34
• 3.1.4 主要仪器设备及来源34-35
• 3.2 方法35-41
• 3.2.1 奶牛和黄牛单核细胞的分离35
• 3.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成35-37
• 3.2.3 CD18和CD11c的PCR产物的胶回收37
• 3.2.4 重组质粒pGME T easy CD18的构建37-38
• 3.2.5 质粒的制备与鉴定38
• 3.2.6 pGEM Teasy CDl8基因测序38-39
• 3.2.7 真核表达质粒pCI neo CD18的构建39-40
• 3.2.8 真核表达质粒pcDNA3.1 CD11c的构建40
• 3.2.9 奶牛与黄牛的CD11c和CD18序列分析40-41
• 3.2.10 CD11c蛋白结构预测41
• 3.3 结果41-52
• 3.3.1 CD18基因的PCR扩增结果41
• 3.3.2 CD18基因T A克隆的PCR及双酶切鉴定结果41-42
• 3.3.3 pCI neo CD18真核表达质粒鉴定结果42-43
• 3.3.4 CD18基因的序列分析结果43-44
• 3.3.5 CD11c基因PCR扩增结果44-45
• 3.3.6 pcDNA3.1 CD11c真核表达质粒鉴定结果45
• 3.3.7 CD11c蛋白生物信息学分析45-52
• 3.4 讨论与小结52-56
• 第四章 LKT结合表达CD18，CD11c和CR4的 293T细胞系56-68
• 4.1 材料56-57
• 4.1.1 细菌菌株和质粒载体56
• 4.1.2 工具酶与主要生化试剂56
• 4.1.3 试剂盒及其他56
• 4.1.4 主要仪器设备及来源56-57
• 4.2 方法57-60
• 4.2.1 293T细胞的复苏和活化57
• 4.2.2 293T细胞的传代57
• 4.2.3 质粒的瞬时转染57-58
• 4.2.4 间接免疫荧光检测CD18，CD11c和CR4蛋白的表达58
• 4.2.5 RT PCR检测CD18，CD11c和CR4蛋白的表达58
• 4.2.6 Western Blot检测CD18，CD11c和CR4蛋白的表达58-59
• 4.2.7 MTT分析LKT诱导细胞毒性作用59-60
• 4.3 结果60-64
• 4.3.1 间接免疫荧光检测CD11c，CD18和CR4蛋白表达结果60-61
• 4.3.2 RT PCR检测HEK 293T细胞表达CD11c，CD18和CR4蛋白61-62
• 4.3.3 Western Blot分析表达CD11c，CD18和CR4蛋白的结果62-63
• 4.3.4 MTT检测LKT分别感染表达CD18、CD11c和CR4的细胞活性63-64
• 4.4 讨论与小结64-68
• 第五章 全文结论68-70
• 参考文献70-88
• 致谢88-90
• 附录90-92
• 个人简历92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王萍萍;高锐;张伟;黄艳;;曼氏杆菌病(Mannheimiosis)[J];畜牧兽医科技信息;2007年10期

2 张永久;王萍萍;武广文;;溶血性曼氏杆菌毒素的作用及其分子致病机理[J];黑龙江畜牧兽医;2007年07期

3 完马单智;防治牛出败病的体会[J];青海畜牧兽医杂志;2003年02期

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1 陈立志;牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D];吉林大学;2008年

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