miR-449a对LGR4在奶山羊子宫内膜基质细胞中靶向调控作用的研究

发布时间：2017-05-12 13:06

  本文关键词：miR-449a对LGR4在奶山羊子宫内膜基质细胞中靶向调控作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：mi RNAs是一类小的非编码RNA,以特定的序列调控基因的转录后表达。miR-449a可以诱导细胞凋亡和分化,LGR4可以调控生殖细胞的分化。本课题组前期的高通量测序数据结果表明,miR-449a在奶山羊子宫内膜容受期的相对表达量与非容受期相比极显著升高(P0.01),而LGR4的表达量则显著降低(P0.05)。生物信息学分析表明,LGR4为miR-449a的靶基因。因此研究miR-449a对LGR4在奶山羊子宫内膜基质细胞(ESC)中的靶向调控作用对阐明奶山羊子宫内膜容受性形成的分子机理具有重要意义。本研究以西农萨能奶山羊为研究对象,利用stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR检测mi R-449a和LGR4在奶山羊子宫内膜容受期和非容受期的差异性表达,通过双荧光素酶报告载体系统、RT-qPCR、Western blot、MTT、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测以及细胞周期分析等技术,研究miR-449a对靶基因LGR4的调控,检测miR-449a对ESC的影响以及对P53、Bcl-2和FAS的表达调控作用。本研究主要取得的结果如下:1.通过stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR分别验证mi R-449a和LGR4在奶山羊子宫内膜容受期和非容受期的相对表达量。结果表明,与非容受期相比,miR-449a在子宫内膜容受期显著高表达(P0.05),而LGR4 mRNA则显著低表达(P0.05)。2.构建野生型psiCHECK2-LGR4-3′UTR-WT和突变型psiCHECK2-LGR4-3′UTR-Mut双荧光素酶载体,分别与mi R-449a mimic、miR-449a inhibitor、Negative control(NC)和Negative control inhibitor(NCH)共转染到HEK293T细胞中。结果显示,与mi R-449a共转染的试验组的荧光素酶活性显著低于Negative control对照组(P0.05),表明mi R-449a通过与LGR4-3′UTR相互作用导致荧光素酶活性降低,初步鉴定LGR4为mi R-449a的靶基因。3.将miR-449a转染到ESC和HEK293T细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测LGR4在转录水平和蛋白水平上的表达,结果显示miR-449a在转录水平和蛋白水平上抑制了靶基因LGR4的表达。结果表明,miR-449a负调控靶基因LGR4的表达。4.mi R-449a转染ESC后,通过MTT法、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测、细胞周期分析等技术检测miR-449a对ESC的影响,结果显示,miR-449a使ESC停滞在S期(39.09%Vs 36.13%),且miR-449a抑制ESC的增殖,并诱导ESC凋亡。mi R-449a下调P53在ESC中的表达,抑制FASmRNA的表达,但不影响Bcl-2的表达。由试验结果可知,miR-449a可能通过FAS介导的通路诱导ESC凋亡。
【关键词】：奶山羊 子宫内膜容受性 miR-449a LGR4 子宫内膜基质细胞
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-11
• 文献综述11-21
• 第一章 miRNA对子宫内膜容受性形成的研究进展11-21
• 1.1 子宫内膜的研究进展11-15
• 1.1.1 子宫的结构和功能11
• 1.1.2 子宫内膜的结构11-12
• 1.1.2 子宫内膜的功能12-13
• 1.1.3 子宫内膜细胞的概述13-14
• 1.1.4 子宫内膜容受性研究进展14
• 1.1.5 子宫内膜容受性对胚胎植入的作用14-15
• 1.2 miR-449a的研究进展15-17
• 1.2.1 miRNA的研究进展15-16
• 1.2.2 mi R-449家族的研究概述16-17
• 1.2.3 mi R-449a的研究进展17
• 1.3 LGR4的研究进展17-19
• 1.3.1 LGR家族的研究概况17-18
• 1.3.2 LGR4的研究概述18-19
• 1.3.3 LGR4的信号传导途径概述19
• 1.3.4 LGR4在子宫内膜容受性形成中的研究19
• 1.4 本研究的目的与意义19-21
• 试验研究21-49
• 第二章 miR-449a对LGR4在奶山羊子宫内膜基质细胞的靶向调控作用21-49
• 2.1 引言21
• 2.2 材料和方法21-34
• 2.2.1 材料和试剂21-22
• 2.2.2 方法22-34
• 2.3 结果与分析34-45
• 2.3.1 mi R-449a和LGR4在奶山羊子宫内膜容受期和非容受期的差异性表达34-36
• 2.3.2 mi R-449a靶基因LGR4的预测36
• 2.3.3 psiCHECK2-LGR4-3′UTR双荧光素酶报告载体的构建与检测36-38
• 2.3.4 奶山羊子宫内膜基质细胞（ESC）鉴定38
• 2.3.5 mi R-449a调控LGR4在ESC中的表达38-40
• 2.3.6 mi R-449a对ESC增殖、凋亡及细胞周期的检测40-45
• 2.4 讨论45-49
• 结论49-50
• 创新点50
• 进一步研究问题50-51
• 参考文献51-61
• 附录61-68
• 致谢68-69
• 作者简介69

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