细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响

发布时间：2017-05-12 13:08

  本文关键词：细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：轮状病毒(Rotavirus,RV)引起的疾病是一种人畜共患传染病,主要感染5岁以下儿童及幼龄动物,以脱水性胃肠炎为特征,严重时可导致死亡。轮状病毒造成了巨大的社会负担及经济损失,但轮状病毒的治疗尚无特效药。当前两个商品化口服活疫苗虽在发达国家效果较好,但在低收入国家免疫效果不好,安全性也存在争议。因此,开发特效治疗轮状病毒的药物和生产高效的疫苗迫在眉睫。轮状病毒侵入宿主细胞的机制尚不明确,研究出轮状病毒侵入宿主细胞的机制是必要的,为药物和疫苗的研发提供借鉴。本实验以牛轮状病毒UK株为模板,原核表达VP6基因的编码区全序列。并与弗氏佐剂乳化后免疫豚鼠,分离血清,制备豚鼠抗VP6蛋白的多克隆抗体,检测多克隆抗体的特性。用蔗糖或NH4Cl处理Caco-2细胞,并设置非处理组,确定网格蛋白受到破坏或内体酸化受到抑制,孵育轮状病毒UK株或RRV株,通过间接免疫荧光实验检测病毒的感染是否受到抑制。另一实验通过荧光定量PCR的方法定量VP6的转录差异。实验结果成功制备抗VP6多克隆抗体,具有良好的反应性,均可以与UK、RRV株轮状病毒反应。蔗糖处理Caco-2和MA104细胞,破坏了细胞的网格蛋白,间接免疫荧光证明,与非处理组相比,UK组轮状病毒颗粒数量明显减少,RRV组轮状病毒颗粒数量未有明显改变,这一结果表明UK株轮状病毒侵入细胞依赖于网格蛋白,RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于网格蛋白。NH4Cl处理Caco-2和MA104细胞,抑制细胞的内体酸化,间接免疫荧光中与非处理组相比,UK组病毒颗粒数量明显减少,RRV组病毒颗粒数量未有明显改变,这一结果表明UK株轮状病毒侵入细胞依赖于内体,RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于内体的酸化。另一组实验,经蔗糖和NH4Cl处理的Caco-2细胞或MA104细胞,接种轮状病毒后,实时定量PCR表明,UK株VP6基因含量与对照组相比显著下降,RRV株VP6基因含量与对照组相比略有差异。在Caco-2细胞和MA104细胞上得出的结果一致。综上所述,无论在易感轮状病毒的MA104细胞上,还是模拟小肠天然环境上皮细胞的Caco-2细胞上,UK株轮状病毒侵入细胞依赖于网格蛋白和内体的酸化,而RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于网格蛋白和内体的酸化。本结论对阐明轮状病毒侵入机制具有重要意义,也为轮状病毒胃肠炎药物的开发提供参考。
【关键词】：轮状病毒 网格蛋白 多克隆抗体 VP6基因 内体 侵入
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-11
• 第一章 文献综述11-27
• 1.1 引言11
• 1.2 轮状病毒分类及主要结构蛋白11-14
• 1.2.1 分类11-12
• 1.2.2 主要结构蛋白12-14
• 1.3 轮状病毒分子流行病学14-16
• 1.3.1 人轮状病毒流行病学14-15
• 1.3.2 动物轮状病毒流行病学15-16
• 1.4 轮状病毒的临诊症状、诊断、治疗及防控16-17
• 1.4.1 轮状病毒临诊症状16
• 1.4.2 轮状病毒的诊断16
• 1.4.3 轮状病毒的疾病治疗16
• 1.4.4 轮状病毒疾病的防控16-17
• 1.5 轮状病毒受体17-22
• 1.5.1 唾液酸18-19
• 1.5.2 整合素19-21
• 1.5.3 热休克蛋白hsc7021-22
• 1.5.4 脂筏22
• 1.6 轮状病毒侵入细胞的复杂过程22-24
• 1.7 病毒侵入细胞的机制24-25
• 1.8 研究的意义25-27
• 第二章 轮状病毒VP6多克隆抗体的制备27-49
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 病毒、细胞、质粒及菌株27
• 2.1.2 实验动物27
• 2.1.3 主要试剂27
• 2.1.4 主要仪器设备27-28
• 2.2 方法28-39
• 2.2.1 引物的设计与合成28
• 2.2.2 细胞培养及轮状病毒UK株的扩增28-29
• 2.2.3 TRIzol法提取RNA29
• 2.2.4 反转录29-30
• 2.2.5 PCR30
• 2.2.6 轮状病毒UK株VP6基因亚克隆30-32
• 2.2.7 碱裂解法小量提取质粒32-33
• 2.2.8 重组质粒的鉴定33-34
• 2.2.9 重组质粒在大肠杆菌的表达34-35
• 2.2.10 重组蛋白的大量表达及纯化35-36
• 2.2.11 纯化后蛋白的浓缩36
• 2.2.12 浓缩后蛋白的定量36-37
• 2.2.13 纯化后蛋白的Western-blotting分析37
• 2.2.14 多克隆抗体的制备37-38
• 2.2.15 多克隆抗体的检测38-39
• 2.3 结果39-46
• 2.3.1 轮状病毒UK株VP6基因的扩增39-40
• 2.3.2 重组质粒的鉴定40
• 2.3.3 轮状病毒VP6表达产物的SDS-PAGE结果分析40-41
• 2.3.4 纯化后重组蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析41-42
• 2.3.5 Western blotting结果分析42
• 2.3.6 Western blotting检测多克隆抗体的反应性42-43
• 2.3.7 ELISA检测多克隆抗体的效价43-44
• 2.3.8 间接免疫荧光检测抗体与病毒的反应性44-46
• 2.4 讨论46-49
• 第三章 网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响49-67
• 3.1 材料49
• 3.1.1 主要试剂49
• 3.1.2 病毒及细胞49
• 3.1.3 主要仪器设备49
• 3.2 方法49-52
• 3.2.1 病毒的浓缩49-50
• 3.2.2 间接免疫荧光实验50-51
• 3.2.3 荧光定量PCR51-52
• 3.3 结果52-65
• 3.3.1 网格蛋白被抑制结果52-53
• 3.3.2 抑制网格蛋白对轮状病毒侵入的影响53-57
• 3.3.3 抑制内体酸化对轮状病毒侵入的影响57-61
• 3.3.4 实时定量PCR结果61-65
• 3.4 讨论65-67
• 第四章 全文结论67-69
• 参考文献69-79
• 致谢79-81
• 个人简历81

【参考文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 李跃;儿童轮状病毒腹泻的分子流行病学研究[D];复旦大学;2013年

  本文关键词：细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：359844