人参和人Cu/Zn-SOD基因的克

发布时间：2022-01-20 15:35

　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）是一类非常普遍的抗氧化酶,能够保护细胞免受活性氧的损害。目的：本研究目的在于通过构建人参超氧化物歧化酶（pCu/Zn-SOD）、人铜锌超氧化物歧化酶（hCu/Zn-SOD）基因与pET-22b载体的重组体系,获得重组质粒,实现两种酶的表达、纯化,并进行活性分析,以获得高表达量和高活性的SOD,以用于动物疾病的检测与防治。方法：（1）提取人参和人的总RNA,并通过RT-PCR获得目的基因。将目的基因与pET-22b （+）载体连接,采用双酶切和PCR检测以证明载体构建成功,然后测序。（2）将pET-22b-Cu/ZnSOD重组质粒转入BL21进行诱导表达,收集上清并浓缩,利用superdex75分子筛层析和DEAE Fast Flow离子交换层析进行蛋白纯化。（3）利用Bradford方法测定蛋白浓度,并用邻苯三酚法测定酶活性。（4）利用SWISS-Model对pCu/Zn-SOD的三维结构进行了预测,并与hCu/Zn-SOD的三维结构进行了比较。（5）探讨了不同温度和不同pH对酶活性的影响。结果：（1）成功构建了重组质... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 超氧化物歧化酶的研究
    2 人参铜锌超氧化物歧化酶研究
    3 生物体内的氧化及抗氧化
        3.1 自由基、活性氧
        3.2 非酶类抗氧化分子简介
    4 超氧化物歧化酶的作用机制
    5 超氧化物歧化酶的应用
        5.1 抗肿瘤和抗辐射
        5.2 防治心脑血管疾病
        5.3 作为某些疾病的检测指标
        5.4 具有抗炎症作用
        5.5 用于动物保健
    6 蛋白质浓度的测定方法
        6.1 双缩脲法
        6.2 考马斯亮蓝法
        6.3 紫外分光光度法
        6.4 BCA法
    7 超氧化物歧化酶的活性测定
    8 超氧化物歧化酶吸收机制
    9 SOD的获得途径
        9.1 植物SOD的提取
        9.2 动物SOD的提取
        9.3 利用基因手段获得高纯度SOD
    10 研究目的及意义
第二章 人和人参Cu/Zn-SOD基因表达载体的构建
    1 材料
        1.1 工具酶和其它指示剂
        1.2 主要溶液的配制
        1.3 培养基
        1.4 主要使用仪器
    2 方法
        2.1 SWISS同源建模
        2.2 总RNA的提取
        2.3 CDNA的合成
        2.4 引物的设计与合成
        2.5 目的基因的克隆
        2.6 1%琼脂糖凝胶电泳
        2.7 PCR产物的回收纯化
        2.8 目的基因的酶切、连接、转化
            2.8.1 载体和基因的酶切
            2.8.2 T4酶连接
            2.8.3 连接产物的转化入DH5a
        2.9 重组载体正确性鉴定
            2.9.1 重组质粒提取
            2.9.2 质粒PCR鉴定和双酶切鉴定
    3 结果
        3.1 SWISS-MODEL同源建模分析
        3.2 基因扩增PCR结果
        3.3 两种酶构建载体正确性验证
        3.4 测序结果与分析
    4 讨论
        4.1 载体的选择
        4.2 酶切位点及抗生素的使用选择
        4.3 SWISS建模
第三章 人和人参Cu/Zn-SOD蛋白的表达纯化及活性分析
    1 材料与方法
        1.1 主要溶液的配制
        1.2 主要使用仪器及设备
    2 方法
        2.1 SOD蛋白的表达
            2.1.1 SOD在不同浓度IPTG浓度下的表达情况
            2.1.2 SOD在不同诱导时间下的表达情况
            2.1.3 SOD在不同温度下的表达情况
        2.2 蛋白纯化
            2.2.1 Superdex 75 10/300 GL纯化
            2.2.2 Hitrap DEAE FF纯化
        2.3 蛋白浓度的测定
        2.4 SOD蛋白的活性测定
        2.5 不同PH对两种酶活性的影响
        2.6 不同温度对两种酶活性的影响
    3 结果与分析
        3.1 SOD表达结果
        3.2 SOD时间梯度诱导结果
        3.3 SOD温度梯度诱导结果
        3.4 SOD IPTG浓度梯度诱导结果
        3.5 SOD纯化结果
        3.6 SOD浓度的测定
        3.7 SOD活性鉴定结果
        3.8 温度对SOD活性的影响
        3.9 PH对SOD活性的影响
    4 讨论
        4.1 蛋白诱导表达
        4.2 蛋白纯化及活性测定
结论
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]经皮吸收制剂的研究进展[J]. 谭纹,杨建龙,雷雪,高鑫,李庆玲.  中国中医药现代远程教育. 2013(18)
[2]超氧化物歧化酶在疾病检测中的临床价值[J]. 袁秀梅,齐发梅,司玉春,张哲梅,王爱霞,贾彦娟.  国际检验医学杂志. 2013(10)
[3]超氧化物歧化酶的生物学效应和在血管性疾病中的作用[J]. 陈珊,程熠,刘全.  中国老年学杂志. 2013(04)
[4]人参水溶性蛋白的提取及SOD活性测定[J]. 姚刚,刘宏,欧阳昌汉.  时珍国医国药. 2012(05)
[5]玉米超氧化物歧化酶的提取与纯化工艺[J]. 刘杰凤,张峰培,杜丽明.  食品研究与开发. 2012(05)
[6]人参中化学成分分析技术研究进展[J]. 李青,方赤光,刘思洁,曹志强.  人参研究. 2011(03)
[7]毕赤酵母表达重组人源Cu/Zn SOD的分离纯化与稳定性表征[J]. 杨志强,张晨,敖伟,蔡泽恩,刘树滔,饶平凡.  中国食品学报. 2011(05)
[8]重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化[J]. 刘建荣,宋苍苍.  中国医药工业杂志. 2011(07)
[9]鸭血提取SOD工艺优化[J]. 夏骏,毛俞硕,苏日嘎.  硅谷. 2011(03)
[10]超氧化物歧化酶对大鼠根尖周炎的作用效应[J]. 王青山,舒静媛,张燕,王晶.  生物医学工程学杂志. 2010(05)

博士论文
[1]人参鹿茸中蛋白多肽的纯化及活性研究[D]. 严铭铭.长春中医药大学 2007
[2]植物内生蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及体外表达酶活性分析[D]. 尚玉磊.浙江大学 2004

硕士论文
[1]SOD检测在中枢神经系统白血病诊断中的意义及青蒿琥酯干扰作用机制探讨[D]. 钟敏.南方医科大学 2009
[2]人CuZn-SOD突变基因在聚球藻中的高效表达及活性研究[D]. 高淑彬.厦门大学 2007



本文编号：3599081