牛乳腺上皮细胞中bta-miR-145功能的初步研究

发布时间：2022-01-23 08:35

　　乳腺是动物成年后经历增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺发育和泌乳机理的研究对提高奶牛的生产性能及乳品质非常重要。microRNAs是一类在转录后调节基因表达的短的非编码RNA。从microRNA的角度研究其对奶牛乳腺发育和泌乳机理的调控是一个较新的研究领域。本试验选取在奶牛分娩前后有差异表达的bta-miR-145为研究对象，通过生物信息学分析、文献报道比较、3’RACE测序、细胞转染、RT-qPCR、Western Blotting、双荧光报告分析等方法在牛乳腺上皮细胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究内容如下：1.为了挖掘更多的与bta-miR-145相关的信息，对bta-miR-145进行了生物信息学分析。通过MEGA5.05软件对牛的bta-mir-145进行种系发育分析，发现牛与人和猪的microRNA145同源关系较近；通过miR TarBase数据对miR-145进行已验证靶标收集，发现在人和小鼠上miR-145靶向IRS1；将Target Scan6.2预测的bta-miR-145的648个靶标带入DAVID数据库进行KEGG信号通路分析，发现大部分靶... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
表目录
图目录
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 研究目的和意义
    1.2 国内外研究现状
        1.2.1 microRNA 的概述
        1.2.2 与奶牛乳腺发育和泌乳相关的 microRNA 的研究进展
        1.2.3 bta-miR-145 的研究进展
        1.2.4 bta-miR-145 的生物信息学分析
    1.3 研究内容和技术路线
        1.3.1 研究内容
        1.3.2 技术路线
第二章 牛 IRS1 基因的 3′RACE 测序及结合位点分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 牛乳腺组织 Total RNA 提取
        2.1.2 已知序列验证
        2.1.3 3 ′端序列获取
        2.1.4 RACE 序列验证
        2.1.5 序列拼接
        2.1.6 对测得的 IRS13’RACE 序列进行生物信息学分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 牛乳腺组织 Total RNA 提取结果
        2.2.2 已知序列验证结果
        2.2.3 3 ′端序列获取结果
        2.2.4 RACE 序列验证结果
        2.2.5 用 Sequencher 4.9 软件对上述测得的序列进行拼接的结果
        2.2.6 对测得的 IRS13’RACE 序列进行生物信息学分析结果
    2.3 讨论
    2.4 结论
第三章 奶牛乳腺上皮细胞系的建立及β-酪蛋白的诱导表达
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要设备、试剂、耗材
        3.1.2 培养液
        3.1.3 奶牛乳腺上皮细胞原代培养
        3.1.4 奶牛乳腺上皮细胞的纯化
        3.1.5 奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白-18 鉴定
        3.1.6 奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏
        3.1.7 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线的绘制
        3.1.8 奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的诱导表达
    3.2 结果与分析
        3.2.1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养
        3.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化
        3.2.3 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线
        3.2.4 免疫细胞荧光染色法鉴定乳腺上皮细胞角蛋白-18 的表达
        3.2.5 奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的诱导表达结果
    3.3 讨论
    3.4 结论
第四章 bta-miR-145 mimic、inhibitor 转染条件的摸索及对细胞活力的影响
    4.1 材料与方法
        4.1.1 转染前细胞接种密度的摸索
        4.1.2 转染时 RNAi 与脂质体 2000 的最适添加量
        4.1.3 qPCR 检测转染后 miR-145 过表达和抑制表达的效果
        4.1.4 转染后的细胞活力检测
        4.1.5 miR-145 过表达和抑制表达后对的其它几种 microRNA 基因表达的影响
    4.2 结果与分析
        4.2.1 转染前细胞接种密度的摸索结果
        4.2.2 转染时 RNAi 与脂质体 2000 的最适添加量及转染效率
        4.2.3 qPCR 检测牛乳腺上皮细胞中 miR-145 过表达和抑制表达的效果
        4.2.4 转染后的细胞活力检测结果
        4.2.5 miR-145 过表达和抑制表达对其它几种 microRNA 的影响
    4.3 讨论
    4.4 结论
第五章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的 RT-qPCR 验证及 Western Blot 验证
    5.1 材料与方法
        5.1.1 细胞处理和瞬时转染
        5.1.2 样品 RNA 提取、反转录及荧光定量反应
        5.1.3 Western Blot 试验的主要设备、试剂、耗材
        5.1.4 细胞蛋白样品的制备
        5.1.5 SDS-PAGE 电泳
        5.1.6 转膜
        5.1.7 封闭、抗体孵育和显色
    5.2 结果与分析
        5.2.1 过表达对预测靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表达的影响
        5.2.2 抑制表达对预测靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表达的影响
        5.2.3 BCA 法测定蛋白浓度标准曲线绘制
        5.2.4 SDS-PAGE 胶考马斯亮兰的染色结果
        5.2.5 丽春红染膜的结果
        5.2.6 转染后牛乳腺上皮细胞中 IRS1 和 CSN2 蛋白表达的变化
    5.3 讨论
    5.4 结论
第六章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的双荧光报告基因检测
    6.1 材料与方法
        6.1.1 主要设备、试剂、耗材
        6.1.2 牛乳腺组织 RNA 的提取和反转录
        6.1.3 牛重组载体 CSN2-WT 和 IRS1-WT 的构建
        6.1.4 双荧光素酶报告载体分析 miRNA 作用靶点
    6.2 结果与分析
        6.2.1 基因 3’UTR PCR 扩增结果
        6.2.2 重组载体菌液 PCR、双酶切和测序结果
        6.2.3 双荧光素酶表达分析结果
    6.3 讨论
    6.4 结论
第七章 全文结论
    7.1 结论
    7.2 本试验创新点
    7.3 有待于进一步研究的问题
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3603984