IFNα/IFNγ和sIFITM3抗FMDV效应和口蹄疫重组假型杆状病毒的构建及免疫原性研究
发布时间：2022-01-24 03:01
口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是一种可引起偶蹄动物发病的高度接触性传染病。该病是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的,典型症状是病畜高热,跛行,在蹄部、舌、口、乳房等处产生水泡,该病发病率高,但死亡率低,造成了很大的经济损失。目前对于该病的防治主要通过疫苗接种,但是FMDV有七个不同的血清型,抗原变异快,不同血清型之间没有交叉保护,因而给本病的预防带来一定的困难。另外,目前主要使用的是灭活疫苗,但其在使用和生产过程中存在安全风险,因此研制安全、高效的新型生物制剂成为越来越多研究者关注的问题。干扰素（IFN）是一种多效的细胞因子,它能作用于相应的受体,激活信号通路并诱导干扰素刺激基因（ISGs）的大量转录,表达相关的功能性蛋白,最终起到抗病毒作用。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素作用于不同的受体,有协同抗病毒效果。IFITM3是由IFN诱导产生的一种跨膜蛋白家族成员,在抗病毒、抗肿瘤及免疫监视等方面发挥着重要的作用。近年来杆状病毒越来越多的应用到研究和临床生产中,不仅在于其自身在表达修饰方面的优势,它还不存在安全性问...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语列表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 口蹄疫简介
1.1.1 简述口蹄疫的危害及其现状
1.1.2 口蹄疫病毒的分子生物学
1.1.3 口蹄疫现状及新型口蹄疫疫苗
1.1.3.1 传统疫苗
1.1.3.2 新型FMD疫苗
1.2 干扰素简介
1.2.1 干扰素的发展和作用
1.2.2 干扰素的分型
1.2.3 IFN的诱导表达
1.2.4 IFN的作用机理
1.2.5 干扰素刺激基因(ISGs)
1.2.6 干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)
1.3 杆状病毒表达系统
1.3.1 简述杆状病毒
1.3.2 杆状病毒作为载体的进展
1.3.3 杆状病毒作为载体的优势
2 目的和意义
3 材料和方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、细胞及毒株
3.1.2 质粒载体
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要培养基的配制
3.1.5 主要缓冲液
3.1.5.1 质粒提取缓冲液
3.1.5.2 Western blot缓冲液
3.1.6 其他溶液
3.1.7 本实验所用各种PCR引物
3.2 试验方法
3.2.1 PCR获得目的基因
3.2.2 限制性内切酶酶切反应
3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.5 外源DNA片段与载体的连接反应
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.7 连接产物的转化
3.2.8 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒)
3.2.9 质粒DNA的定量
3.2.10 重组质粒的鉴定
3.2.11 蓝白斑筛选
3.2.12 重组穿梭载体(Bacmid)的提取
3.2.13 脂质体介导的转染
3.2.14 重组假型杆状病毒转导哺乳动物细胞
3.2.15 构建重组假型杆状病毒的操作流程及示意图
3.2.16 Western blot检测目的蛋白的表达
3.2.16.1 样品的处理
3.2.16.2 SDS-PAGE电泳
3.2.16.3 Western blot检测
3.2.17 空斑减少试验检测
3.2.18 荧光定量PCR
3.2.18.1 样品的制备
3.2.18.2 总RNA的提取
3.2.18.3 cDNA的合成
3.2.18.4 实时荧光定量PCR检测
3.2.18.4.1 实时荧光定量PCR试验
3.2.18.4.2 实时荧光PCR相对定量mRNA表达水平的计算
3.2.19 动物试验
3.2.19.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的动物试验方案
3.2.19.2 动物试验血清的中和抗体检测
3.2.19.3 动物试验血清的ELISA抗体检测
3.2.19.4 动物试验血清的ELISA抗体检测(韩国金诺ELISA试剂盒)
3.2.19.5 外周血单个核细胞(PBMCs)细胞的分离
3.2.20 统计学方法
4 结果与分析
4.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的构建及抗病毒活性的研究
4.1.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的构建
4.1.1.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的构建
4.1.1.1.1 重组转移载体的构建
4.1.1.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的获得
4.1.1.1.3 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的Western blot检测
4.1.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ的获得
4.1.1.2.1 重组转移载体的构建
4.1.1.2.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ的获得
4.1.1.3 重组杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的获得
4.1.1.3.1 转移载体的构建
4.1.1.3.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的获得
4.1.1.3.3 重组杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的Western blot检测
4.1.1.4 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的抗病毒效果检测
4.1.1.4.1 Ac-VSVG-IFN-α在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.2 Ac-VSVG-IFN-γ在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.3 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ转导细胞后ISGs的转录
4.1.1.4.4 Ac-VSVG-sIFITM3在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.5 重组杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的协同抗病毒效应的初步探索
4.1.1.4.5.1 Ac-VSVG-IFN-α和Ac-VSVG-IFN-γ的协同抗病毒效应
4.1.1.4.5.2 Ac-VSVG-IFN-γ和Ac-VSVG-sIFITM3的协同抗病毒效应
4.1.1.4.5.3 Ac-VSVG-IFN-γ/sIFITM3的协同抗病毒效应
4.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的构建及免疫效力试验
4.2.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的获得
4.2.1.1 FMDV P1基因的获得和转移载体的构建
4.2.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的获得
4.2.2 Ac-VSVG-IFN-γ-2P1在细胞上的抗病毒效果
4.2.3 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的动物试验
4.2.3.1 动物试验血清ELISA水平的检测
4.2.3.2 中和抗体水平的检测
4.2.3.3 PBMCs中ISGs的检测
5 讨论
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3605708
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语列表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 口蹄疫简介
1.1.1 简述口蹄疫的危害及其现状
1.1.2 口蹄疫病毒的分子生物学
1.1.3 口蹄疫现状及新型口蹄疫疫苗
1.1.3.1 传统疫苗
1.1.3.2 新型FMD疫苗
1.2 干扰素简介
1.2.1 干扰素的发展和作用
1.2.2 干扰素的分型
1.2.3 IFN的诱导表达
1.2.4 IFN的作用机理
1.2.5 干扰素刺激基因(ISGs)
1.2.6 干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)
1.3 杆状病毒表达系统
1.3.1 简述杆状病毒
1.3.2 杆状病毒作为载体的进展
1.3.3 杆状病毒作为载体的优势
2 目的和意义
3 材料和方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、细胞及毒株
3.1.2 质粒载体
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要培养基的配制
3.1.5 主要缓冲液
3.1.5.1 质粒提取缓冲液
3.1.5.2 Western blot缓冲液
3.1.6 其他溶液
3.1.7 本实验所用各种PCR引物
3.2 试验方法
3.2.1 PCR获得目的基因
3.2.2 限制性内切酶酶切反应
3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.5 外源DNA片段与载体的连接反应
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.7 连接产物的转化
3.2.8 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒)
3.2.9 质粒DNA的定量
3.2.10 重组质粒的鉴定
3.2.11 蓝白斑筛选
3.2.12 重组穿梭载体(Bacmid)的提取
3.2.13 脂质体介导的转染
3.2.14 重组假型杆状病毒转导哺乳动物细胞
3.2.15 构建重组假型杆状病毒的操作流程及示意图
3.2.16 Western blot检测目的蛋白的表达
3.2.16.1 样品的处理
3.2.16.2 SDS-PAGE电泳
3.2.16.3 Western blot检测
3.2.17 空斑减少试验检测
3.2.18 荧光定量PCR
3.2.18.1 样品的制备
3.2.18.2 总RNA的提取
3.2.18.3 cDNA的合成
3.2.18.4 实时荧光定量PCR检测
3.2.18.4.1 实时荧光定量PCR试验
3.2.18.4.2 实时荧光PCR相对定量mRNA表达水平的计算
3.2.19 动物试验
3.2.19.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的动物试验方案
3.2.19.2 动物试验血清的中和抗体检测
3.2.19.3 动物试验血清的ELISA抗体检测
3.2.19.4 动物试验血清的ELISA抗体检测(韩国金诺ELISA试剂盒)
3.2.19.5 外周血单个核细胞(PBMCs)细胞的分离
3.2.20 统计学方法
4 结果与分析
4.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的构建及抗病毒活性的研究
4.1.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的构建
4.1.1.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的构建
4.1.1.1.1 重组转移载体的构建
4.1.1.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的获得
4.1.1.1.3 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α的Western blot检测
4.1.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ的获得
4.1.1.2.1 重组转移载体的构建
4.1.1.2.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ的获得
4.1.1.3 重组杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的获得
4.1.1.3.1 转移载体的构建
4.1.1.3.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的获得
4.1.1.3.3 重组杆状病毒Ac-VSVG-sIFITM3的Western blot检测
4.1.1.4 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的抗病毒效果检测
4.1.1.4.1 Ac-VSVG-IFN-α在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.2 Ac-VSVG-IFN-γ在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.3 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ转导细胞后ISGs的转录
4.1.1.4.4 Ac-VSVG-sIFITM3在细胞上的抗病毒效果
4.1.1.4.5 重组杆状病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的协同抗病毒效应的初步探索
4.1.1.4.5.1 Ac-VSVG-IFN-α和Ac-VSVG-IFN-γ的协同抗病毒效应
4.1.1.4.5.2 Ac-VSVG-IFN-γ和Ac-VSVG-sIFITM3的协同抗病毒效应
4.1.1.4.5.3 Ac-VSVG-IFN-γ/sIFITM3的协同抗病毒效应
4.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的构建及免疫效力试验
4.2.1 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的获得
4.2.1.1 FMDV P1基因的获得和转移载体的构建
4.2.1.2 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的获得
4.2.2 Ac-VSVG-IFN-γ-2P1在细胞上的抗病毒效果
4.2.3 重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的动物试验
4.2.3.1 动物试验血清ELISA水平的检测
4.2.3.2 中和抗体水平的检测
4.2.3.3 PBMCs中ISGs的检测
5 讨论
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3605708
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3605708.html
