幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究

发布时间：2022-01-25 05:55

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori, Hp）广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素三联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌（H. polyri）NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全（不完全）弗氏佐剂充... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一部分 幽门螺杆菌疫苗的研究进展
    1 幽门螺杆菌的病理损伤机制
        1.1 幽门螺杆菌的生物学特性
        1.2 幽门螺杆菌的感染途径
        1.3 幽门螺杆菌的毒力基因
            1.3.1 幽门螺杆菌尿素酶(urease)
            1.3.2 细胞毒素相关抗原(CagA)
            1.3.3 空泡毒素基因(VacA)
            1.3.4 iceA基因
    2 幽门螺杆菌的治疗
        2.1 幽门螺杆菌的化学药物治疗
        2.2 免疫抗体治疗幽门螺杆菌
        2.3 影响幽门螺杆菌治疗的因素
    3 幽门螺杆菌感染动物模型
        3.1 H. pylori类似菌的自然感染情况
        3.2 H. pylori感染的动物模型
        3.3 动物模型的应用
            3.3.1 动物模型在抗H. pylori治疗方法和疗效研究进展
            3.3.2 动物模型在研究H. pylori致病机理方面的应用
            3.3.3 动物模型在研究H. pylori疫苗中的应用
    4 幽门螺杆菌疫苗免疫机制及其研究进展
        4.1 幽门螺杆菌自然感染的免疫反应
        4.2 幽门螺杆菌疫苗类型的研究进展
            4.2.1 全菌蛋白疫苗
            4.2.2 基因工程疫苗
            4.2.3 载体疫苗
        4.3 国内外幽门螺杆菌疫苗研究的现状
    5 研究目的和意义
        5.1 本研究的目的
        5.2 本研究的意义
第二部分 实验研究
    实验研究一 幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗免疫奶牛
        引言
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌株
                1.1.2 试剂
                1.1.3 试验动物
            1.2 方法
                1.2.1 疫苗准备
                1.2.2 免疫、采样
                1.2.3 血清/乳汁中IgG检测
        2 数据分析
        3 结果与分析
            3.1 奶牛的血清中和牛奶中幽门螺杆菌抗体的动态变化规律
            3.2 免疫后奶牛身体状况
        4 讨论
            4.1 疫苗的免疫途径
            4.2 免疫乳的应用
    实验研究二 幽门螺杆菌UreB/CagA双价口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的构建
        引言
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌株与质粒
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
                1.1.4 主要培养基
            1.2 方法
                1.2.1 幽门螺杆菌的培养
                1.2.2 感受态细菌的制备
                1.2.3 引物设计及PCR反应体系
                1.2.4 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化
                1.2.5 转化的质粒提取鉴定
                1.2.6 pYA3493质粒提取,酶切
                1.2.7 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组减毒猪霍乱沙门菌疫苗的建立
                1.2.8 重组蛋白的表达及鉴定
        2 结果与分析
            2.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增
            2.2 酶切鉴定和和PCR鉴定
            2.3 重组蛋白的表达及鉴定
        3 讨论
            3.1 基因的选择
            3.2 口服疫苗载体的选择
    实验研究三 幽门螺杆菌CagA/UreB沙门氏菌活载体疫苗免疫小鼠的研究
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验动物
                1.1.2 菌株
                1.1.3 主要试剂
                1.1.4 主要仪器
                1.1.5 各种培养基
            1.2 方法
                1.2.1 疫苗准备
                1.2.2 免疫、采样
                1.2.3 幽门螺杆菌特异抗体IgG检测(ELISA)
                1.2.4 组织切片和免疫组化
        2 数据分析
        3 结果与分析
            3.1 血清中抗体分析
            3.2 组织切片和免疫组化
            3.3 不同组织中幽门螺杆菌SS1菌落数
        4 讨论
    实验四 幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光载体的构建及胃黏膜上皮细胞GES-1转染的研究
        引言
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌株与质粒
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
                1.1.4 各种培养基
            1.2 方法
                1.2.1 幽门螺杆菌的培养
                1.2.2 引物设计及PCR反应体系
                1.2.3 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化
                1.2.4 转化的质粒提取鉴定
                1.2.5 质粒pEGFP-N1提取、酶切
                1.2.6 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组质粒的构建
                1.2.7 质粒大量提取
                1.2.8 提纯质粒转染GES-1细胞
                1.2.9 细胞凋亡的检测
                1.2.10 电镜观察
        2 数据分析
        3 结果与分析
            3.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增
            3.2 UreB与pEGFP-N1连接以及酶切结果
            3.3 细胞转染
            3.4 细胞凋亡的检测
            3.5 透射电镜观察
        4 讨论
第三部分 参考文献
第四部分 全文结论和创新点
    结论
    创新点
附录Ⅰ 在读期间发表的学术论文
附录II 参加的学术活动
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用[J]. 黄学勇,许汴利,段广才,范清堂,郗园林.  中国人兽共患病学报. 2010(06)
[2]含抗幽门螺杆菌特异性抗体牛奶清除效果的动物实验研究[J]. 李仕英,时兰春,王缚鲲,张海谱.  中华医院感染学杂志. 2010(09)
[3]幽门螺杆菌基因组多态性的研究进展[J]. 任莉,郭刚,邹全明.  医学研究生学报. 2010(04)
[4]含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究[J]. 甄艳红,韩丽,梁爱心,王庆玲,杨利国.  生物技术通报. 2009(S1)
[5]幽门螺杆菌对胃上皮细胞间隙连接超微结构的影响(英文)[J]. 徐灿霞,贾燕,杨文斌,邹惠芳,王芬,沈守荣.  生物化学与生物物理进展. 2009(06)
[6]表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性[J]. 满晓营,吴斌,罗勇,余腾,赵战勤,徐引弟,郭爱珍,陈焕春.  微生物学报. 2009(04)
[7]流式细胞术研究细胞凋亡的方法与技术[J]. 潘春留,闫雷,娜仁图娜拉,卿素珠,关伟军,马月辉.  现代生物医学进展. 2009(04)
[8]猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用[J]. 赵战勤,徐引弟,吴斌,程相朝,李银聚,汤细彪,张春杰,陈焕春.  生物工程学报. 2009(01)
[9]幽门螺杆菌iceA基因型与胃黏膜病变的相关性[J]. 张彩凤,夏永华,韩宇,常廷民.  世界华人消化杂志. 2008(20)
[10]新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定[J]. 梁爱心,冯细钢,韩丽,滑国华,桑雷,刘兴斌,刘耘,杨利国.  生物工程学报. 2008(06)

硕士论文
[1]幽门螺杆菌相关性胃病保健型免疫乳制品制备的研究[D]. 谭宝.河北医科大学 2007
[2]幽门螺杆菌CagA基因克隆及表达[D]. 丁力.郑州大学 2005



本文编号：3608010