猪肾细胞过表达SelS细胞系的构建及其对OTA毒性的拮抗作用

发布时间：2022-02-19 13:04

　　硒蛋白S（SelS）是一种潴留于内质网和细胞膜的硒蛋白,广泛分布于在生物机体内,如肝脏、肾脏、骨骼肌、脂肪、下丘脑等组织。相关研究显示,硒蛋白S可以保护细胞免于氧化损伤,具有调节细胞氧化还原平衡和抗氧化作用,参与炎症反应和免疫反应,并拮抗内质网应激及其诱导的细胞凋亡。赭曲霉毒素是一种由曲霉属真菌和青霉菌属真菌产出的毒素,其中我们生活关系最密切相关的是赭曲霉毒素A（OTA）。OTA广泛分布于农作物和农产品,并能在动物和人体中富集,造成健康危机。本研究主要通过引物设计,将酶切位点引入目的基因,构建真核载体pcDNA3.1-SelS;通过脂质体转染方法将重组子pcDNA3.1-SelS转染至猪肾细胞（PK15）,筛选出稳定转染的细胞株,细胞分组情况:PK15+pcDNA3.1-SelS转染组、PK15+pcDNA3.1转染组、未转染的正常PK15细胞组;采用OTA损害细胞造模,观察不同细胞组对OTA毒性损伤的影响,初步探讨过表达硒蛋白S的细胞生物学功能。试验一:重组质粒pcDNA3.1-SelS的构建与鉴定本试验通过在Genbank搜索猪硒蛋白S的mRNA,设计引物,并通过PCR、连接T载体... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号与缩略语
前言
第一篇 文献综述
    第一章 硒和硒蛋白S的研究进展
        1 硒和硒蛋白的概述
            1.1 硒元素
            1.2 硒蛋白
            1.3 硒代半胱氨酸插入元件
            1.4 硒蛋白表达的低效性
        2 硒蛋白S的概述
            2.1 硒蛋白S的简介
            2.2 硒蛋白S的生物学功能
        参考文献
    第二章 赭曲霉毒素A的研究进展
        1 赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)的概述
            1.1 OTA的理化性质
            1.2 OTA的合成
            1.3 OTA在动物体内的代谢
        2 OTA的毒性作用
            2.1 OTA的肾毒性和肝毒性
            2.2 OTA的免疫毒害作用
            2.3 OTA的其它破坏作用
        参考文献
第二篇 试验研究
    第三章 重组质粒pcDNA3.1-SelS的构建与鉴定
        1 材料与方法
            1.1 主要试剂与仪器
            1.2 猪肾总RNA的提取和cDNA的合成
            1.3 引物设计合成和目的基因SelS合成
            1.4 连接T载体和阳性克隆筛选与鉴定
            1.5 重组基因pcDNA3.1-SelS的构建和鉴定
        2 结果
            2.1 猪SelS的SECIS序列
            2.2 猪肾组织中扩增SelS基因条带
            2.3 pcDNA3.1-SelS重组子的鉴定
            2.4 pcDNA3.1-SelS测序结果
        3 讨论
        参考文献
    第四章 重组子pcDNA3.1-SelS的稳定转染及表达水平检测
        1 材料与方法
            1.1 主要试剂与仪器
            1.2 猪肾细胞培养与传代
            1.3 pcDNA3.1-SelS和pcDNA3.1质粒DNA的大量抽提
            1.4 重组子pcDNA3.1-SelS细胞稳定转染
            1.5 荧光定量PCR (RT-PCR)法检测转染后SelS基因的转录水平
            1.6 Western Blotting检测转染后SelS蛋白的表达
            1.7 MTT法测细胞增殖性
            1.8 细胞内MDA、SOD和GSH的测定
        2 结果
            2.1 RT-PCR法检测SelS mRNA表达水平
            2.2 Western Blotting检测转染后SelS蛋白的表达
            2.3 细胞增殖性的测定结果
            2.4 细胞内MDA、SOD和GSH的检测结果
        3 讨论
        参考文献
    第五章 过表达SelS保护PK15细胞拮抗OTA的细胞损伤
        1 材料与方法
            1.1 主要试剂与仪器
            1.2 细胞培养与传代
            1.3 MTT检测细胞毒力
            1.4 细胞内MDA、SOD和GSH的测定
        2 结果
            2.1 MTT检测细胞毒力结果
            2.2 细胞内MDA、SOD和GSH测定结果
        3 讨论
        参考文献
全文结论
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]硒蛋白及其对巨噬细胞功能调节作用的研究进展[J]. 孙纳新,王成华.  食品科学. 2012(19)
[2]Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控[J]. 孙昊,王旭东,代杰文,卢境婷,沈国芳.  中国组织工程研究. 2012(10)
[3]人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究[J]. 郭静雅,陈昌友,王志强,张彦军,黄赛男,朱华亭,邱玉华.  细胞与分子免疫学杂志. 2011(12)
[4]抗真菌肽CGA-N46基因多顺反子表达载体的构建与鉴定[J]. 李瑞芳,熊前程,张宗武,黄亮,王彬.  中国生物工程杂志. 2011(12)
[5]miR-122过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证[J]. 马纪,孙奋勇,张越,洪岸.  中国生物工程杂志. 2011(09)
[6]纳米硒在动物营养中的研究进展[J]. 王亮,单安山.  中国畜牧兽医. 2011(04)
[7]硒蛋白的分子生物学及与疾病的关系[J]. 刘琼,姜亮,田静,倪嘉缵.  化学进展. 2009(05)
[8]外源基因转染真核细胞技术的研究进展[J]. 余祖华,丁轲,程相朝,张春杰,李银聚,吴庭才.  安徽农业科学. 2008(21)
[9]赭曲霉毒素A检测方法的研究进展[J]. 杨家玲,岳田利,高振鹏,相启森.  农产品加工(学刊). 2008(06)
[10]赭曲霉毒素A对肉鸡的危害[J]. 陈道付,金海涛,李绍钰.  饲料研究. 2007(11)

硕士论文
[1]SelS基因重组质粒的构建及其对H2O 2引起的血管内皮细胞损伤的拮抗效应[D]. 张秀娟.大连医科大学 2005



本文编号：3632949