冷冻保护剂及抗氧化剂对猪冷冻精子中Caspase介导的细胞调亡的影响

发布时间：2022-02-19 19:46

　　人工授精技术已广泛应用于现代养猪生产,但冷冻精液使用率仅约1%。主要原因在于在冷冻保存过程中,精子结构和功能受到严重破坏,导致冷冻-复苏后精子活力严重下降,配种受胎率降低,窝产仔数减少。尽管在冷冻稀释液成分以及冷冻程序等方面做了大量工作,但效果仍不理想。研究表明冷冻参与精子中Caspase介导的细胞凋亡过程。然而,抗冻保护剂种类及浓度对细胞凋亡相关Caspases基因表达的影响尚不清楚。因此,本研究以添加不同冷冻保护剂、糖类、抗氧化剂的猪冷冻精子为实验材料,采用qRT-PCR.Annexin V-FITC等技术分析解冻猪精子的活率、活力；检测猪精子中Caspase基因在mRNA水平上的表达水平、Caspase蛋白酶活性以及冷冻-解冻后的猪精子膜上磷酯酰丝氨酸外翻（PS）的程度。结果如下：（1）GeNorm结果表明,PGK1,ACTB和RPL4在所有样品中的表达稳定性高,NormFinder结果表明,GAPDH是最稳定的基因。此外,BestKeeper结果表明,三个最稳定的基因是PPIA,GAPDH和RPL4。用不同算法得到的参考基因的排名顺序有一些差异。总之,根据循环阈值变异系数（Ct... 

【文章来源】：四川农业大学四川省211工程院校

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 猪冷冻精液人工授精现状及存在的问题
    1.2 冷冻过程中的精子损伤
        1.2.1 结构与功能损伤
        1.2.2 分子损伤
    1.3 猪精子冷冻保存添加剂概述
        1.3.1 渗透型抗冻剂
        1.3.2 糖类
        1.3.3 抗氧化剂
    1.4 Caspase家族概述
        1.4.1 Caspase的结构、特点及分类
        1.4.2 Caspase的激活机制
    1.5 冷冻与细胞凋亡
    1.6 内参筛选的重要性
    1.7 研究内容与目的意义
2. 材料和方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 所用仪器设备
        2.1.3 药品及主要试剂的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 试验设计
        2.2.2 猪精液冷冻程序
        2.2.3 精子Total RNA的提取
        2.2.4 精子Toal RNA质检
        2.2.5 cDNA的合成
        2.2.6 PCR引物设计
        2.2.7 RT-PCR
        2.2.8 荧光定量PCR
        2.2.9 内参基因筛选
        2.2.10 凋亡试剂盒检测精子冷冻-解冻后Caspase-3(-6/9、-8)的表达情况
        2.2.11 膜联蛋白V的检测
        2.2.12 数据统计与分析
3 结果与分析
    3.1 内参筛选结果
        3.1.1 RNA的质量
        3.1.2 候选内参基因的验证,扩增效率和表达水平
        3.1.3 候选内参基因的表达稳定性
        3.1.4 综合排名顺序
    3.2 猪精子冷冻-解冻后的活率与活力
    3.3 冷冻对Caspase表达的影响
        3.3.1 冷冻稀释液中抗冻剂3%甘油、DMSO、乙二醇对Caspase基因表达的影响
        3.3.2 冷冻稀释液中添加糖类对Caspase基因表达的影响
        3.3.3 冷冻稀释液中添加抗氧化剂对Caspase基因表达的影响
    3.4 冷冻对Caspases蛋白酶活性水平的影响
    3.5 冷冻对膜联蛋白V影响的结果
4 讨论
    4.1 内参基因筛选结果
    4.2 猪精子冷冻-解冻后精子的活率与活力
    4.3 冷冻-解冻后Caspase基因的表达情况
    4.4 冷冻-解冻后Caspase蛋白酶活性
    4.5 膜联蛋白V-FITC染色
5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表文章


【参考文献】：
期刊论文
[1]半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶介导的细胞凋亡对精子发生发育及冷冻保存的影响[J]. 丁丽,曾长军.  中国畜牧兽医. 2013(04)
[2]保护剂在猪精液冷冻保存中的应用[J]. 李益得.  贵州畜牧兽医. 2012(06)
[3]中药多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J]. 荆雪宁,武继彪.  中国中西医结合杂志. 2012(08)
[4]绵羊精子冻融前后差异蛋白质组学研究[J]. 李鸿岩,赵兴绪,张勇,贺钰烜,杨永新.  中国农业科学. 2011(24)
[5]不同添加剂及剂型对猪冷冻精液品质的影响[J]. 谷合勇,刘丑生,哈福,赵俊金,孟飞,朱芳贤,王皓,张渭斌,陈亮.  中国畜牧兽医. 2011(10)
[6]地黄实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 侯维海,孙鹏,陈全家,李先恩.  中国农学通报. 2011(17)
[7]猪精液冷冻保存技术研究进展[J]. 丁威,张芬芬,邢军,陈军,张建生.  江苏农业科学. 2010(05)
[8]Caspase家族与细胞凋亡的关系[J]. 赵瑞杰,李引乾,王会,王广彬,娜日苏,金大鹏,关伟军,马月辉.  中国畜牧杂志. 2010(17)
[9]猪精液冷冻损伤机理研究进展[J]. 宋德荣,王棋文,刘光瑞,张尤嘉.  生物技术通报. 2010(07)
[10]猪精子冷冻损伤研究进展[J]. 陈晓丽,朱化彬,郝海生,杜卫华,赵学明,孙艳艳,胡传活,王栋.  中国生物工程杂志. 2010(07)

硕士论文
[1]冷冻稀释液中添加抗氧化剂对猪精液冷冻保存效果的影响[D]. 任俊玲.四川农业大学 2007
[2]大鼠急性创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及PACAP干预性治疗的实验研究[D]. 王克强.第三军医大学 2005



本文编号：3633510