具有免疫原性ASFV膜蛋白的筛选与鉴定

发布时间：2022-02-20 03:24

　　非洲猪瘟（African swine fever,ASF）,一种高致病性传染病,由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起,其临床症状主要以发热、呼吸和神经系统功能紊乱、内脏器官病变广泛性出血为主。目前ASF无有效的商品化疫苗可以预防、治疗,一经发现只能大规模扑杀,因此寻找和筛选ASFV基因组编码的具有良好免疫原性的蛋白,对于ASFV的致病性研究和检测试剂盒的开发具有重要意义。利用TMHMM分析软件,对ASFV基因组编码的169个蛋白序列进行了分析,发现ASFV编码的35个蛋白有一个或多个跨膜区域,利用WB检测蛋白的表达情况并通过IFA方法鉴定亚细胞定位,发现E199L、KP117R、E183L、B169L、DP148R、E146L、EP84R、EP402R、H108R具有明显的细胞膜定位。本研究根据已经公布的ASFV HLJ/18分离株的基因组的开放阅读框（open reading frames,ORFs）合成ASFV 169个ASFV基因组编码可能的基因,并克隆到pCAGGS-Flag载体,成功构建了169个真核表达质粒。这些ASFV编码蛋白... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号缩略表
第一章 绪论
    1.1 非洲猪瘟病原学
        1.1.1 ASFV基因组与复制
        1.1.2 理化性质
    1.2 重要ASFV蛋白及功能
        1.2.1 具有免疫原性ASFV相关蛋白及功能
        1.2.2 重要ASFV膜蛋白及功能
    1.3 非洲猪瘟流行病学
        1.3.1 流行概况
        1.3.2 易感动物与传播途径
    1.4 非洲猪瘟检测诊断方法
        1.4.1 分子生物学诊断
        1.4.2 免疫学检测
    1.5 非洲猪瘟疫苗的研究进展
    1.6 本研究的目的及意义
第二章 ASFV免疫原性膜蛋白的筛选和鉴定
    2.1 材料
        2.1.1 ASFV毒株、细胞株和质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要溶液及配方
    2.2 方法
        2.2.1 质粒转染试验
        2.2.2 Western blotting试验方法
        2.2.3 激光共聚焦试验
        2.2.4 间接免疫荧光试验
    2.3 结果与分析
        2.3.1 ASFV全基因组的膜蛋白分析
        2.3.2 ASFV膜蛋白的表达鉴定
        2.3.3 IFA方法鉴定ASFV编码的膜蛋白亚细胞定位
        2.3.4 利用WB和IFA方法筛选和鉴定具有免疫原性ASFV编码的膜蛋白
第三章 针对ASFV膜蛋白p17抗体间接ELISA方法的建立
    3.1 材料
        3.1.1 血清与小肽
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要溶液及配方
    3.2 方法
        3.2.1 最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释倍数的确定
        3.2.2 最佳封闭液与封闭时间的确定
        3.2.3 待检血清工作时间的确定
        3.2.4 兔抗猪IgG酶标抗体孵育条件的确定
        3.2.5 显色时间的确定
        3.2.6 临界值的确定
    3.3 结果
        3.3.1 最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定
        3.3.2 最佳封闭液与封闭时间的确定
        3.3.3 待检血清工作时间的确定
        3.3.4 兔抗猪IgG酶标抗体孵育条件的确定
        3.3.5 显色时间的确定
        3.3.6 临界值的确定
第四章 抗ASFV膜蛋白pDP148R单克隆抗体的制备
    4.1 材料
        4.1.1 病毒株、菌株、细胞株、载体
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 方法
        4.2.1 质粒构建
        4.2.2 DP148R重组蛋白的原核表达,鉴定与纯化
        4.2.3 免疫BALB/c小鼠
        4.2.4 DP148R单克隆抗体的制备
    4.3 结果
        4.3.1 ASFVHLJ/18毒株编码的pDP148R蛋白是有重要生物学功能的膜蛋白
        4.3.2 DP148R重组蛋白的原核表达、鉴定与纯化
        4.3.3 杂交瘤细胞筛选及亚克隆
        4.3.4 单克隆抗体特异性检测
第五章 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 杜楠楠,高飞,姜一峰,郑浩,童武,李国新,张宽,张玉娇,黄剑,童光志.  中国兽医科学. 2020(04)
[2]非洲猪瘟的流行特征和传播路线[J]. 张志,康京丽,李晓成.  中国动物检疫. 2018(11)
[3]浅谈非洲猪瘟[J]. 刘海余.  猪业科学. 2018(10)
[4]非洲猪瘟病毒实验室诊断方法的研究进展[J]. 林彦星,曹琛福,杨俊兴,阮周曦,吴江,吕建强,花群义.  中国兽医学报. 2018(10)
[5]非洲猪瘟诊断技术研究进展[J]. 刘贺.  动物医学进展. 2019(07)
[6]我国首例非洲猪瘟的确诊[J]. 王清华,任炜杰,包静月,戈胜强,李金明,李林,樊晓旭,刘春菊,王华,张永强,徐天刚,段亚良,顾贵波,周晨阳,吴晓东.  中国动物检疫. 2018(09)
[7]非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立[J]. 靳雯雯,杨俊兴,花群俊,刘建利,曹琛福,曹胜波,曾少灵,陶虹,阮周曦,吕建强.  中国兽医学报. 2014(07)
[8]非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 崔尚金,胡泉博,刘业兵.  中国预防兽医学报. 2012(10)
[9]一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法[J]. 杨吉飞,关贵全,刘志杰,汪月凤,李有全,马米玲,刘爱红,任巧云,陈泽,苟惠天,杜鹏飞,罗建勋,殷宏.  畜牧兽医学报. 2011(08)
[10]非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用[J]. 杨吉飞,关贵全,刘志杰,汪月凤,李有全,马米玲,刘爱红,任巧云,苟惠天,杜鹏飞,罗建勋,殷宏.  中国动物传染病学报. 2011(04)

博士论文
[1]基于非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的ELISA检测方法建立及应用[D]. 曹琛福.华南农业大学 2016

硕士论文
[1]HP-PRRSV Nsp2和Nsp12单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定[D]. 毕彩鸿.中国农业科学院 2017



本文编号：3634216