猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2022-02-21 10:02

　　猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PoRV）是引发猪病毒性腹泻的主要病原,且三种病原常常混合感染,建立同时检测三种病原的特异性检测方法,在临床诊断上具有重要意义。本研究根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PoRV VP6基因序列保守区设计合成引物,建立了RT-PCR多重快速检测方法。利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板析进行多重RT-PCR扩增,结果显示：该方法可以同时扩增PEDV S基因（682bp）, TGEV S基因（480bp）和PoRV VP6基因（297bp）的特异性DNA片段,其三对扩增引物对除白身病毒以外的其他两种腹泻病毒及猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性：敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3.3×103copies/μL、TGEV模板3.2×103copies/μL和PoRV模板2.8×103copies/μL。用20份临床病料对本研究建立的多重RT-PCR和单-RT-PCR方法进行对比验证,结果显示：两者的总符合率为100%... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省211工程院校

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 病原概述
        1.1.1 猪流行性腹泻病毒
        1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒
        1.1.3 猪轮状病毒
    1.2 PEDV、TGEV、PoRV的诊断方法
        1.2.1 临床诊断
        1.2.2 实验室诊断
    1.3 实时荧光定量PCR技术
        1.3.1 原理
        1.3.2 分类
        1.3.3 应用
    1.4 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 病毒及临床样品
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 引物设计与合成
        2.1.4 病料样品的处理
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 单一病原体基因PCR扩增及测序
        2.2.2 多重RT-PCR扩增
        2.2.3 PCR产物的回收
        2.2.4 目的基因片段与pMD18-T载体的连接
        2.2.5 大肠杆菌JM-109感受态的制备
        2.2.6 连接产物的转化
        2.2.7 pMD18-T基因重组质粒的鉴定
        2.2.8 测序及结果分析
        2.2.9 多重PCR扩增条件的优化
        2.2.10 特异性试验
        2.2.11 敏感性试验
        2.2.12 重复性试验
        2.2.13 临床感染病料的检测
        2.2.14 荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立
        2.2.15 荧光定量PCR的特异性
        2.2.16 荧光定量PCR的重复性
        2.2.17 荧光定量PCR的敏感性
        2.2.18 荧光定量PCR临床样品检测
3 结果与分析
    3.1 多重PCR扩增条件的优化结果
        3.1.1 单一RT-PCR扩增及退火温度的优化结果
        3.1.2 多重RT-PCR引物浓度的优化结果
        3.1.3 多重RT-PCR循环数的优化结果
    3.2 特异性试验结果
    3.3 敏感性试验结果
    3.4 重复性试验结果
    3.5 临床样品的检测
    3.6 荧光定量PCR扩增目的片段电泳结果
    3.7 重组质粒测序结果
    3.8 荧光定量PCR标准曲线
    3.9 荧光定量PCR重复性试验结果
    3.10 荧光定量PCR溶解曲线分析结果
    3.11 荧光定量PCR特异性试验结果
    3.12 荧光定量PCR临床样品检测结果
4 讨论
    4.1 多重RT-PCR方法检测猪腹泻病毒
    4.2 检测猪腹泻病毒的荧光定量PCR方法分析
5 结论
    5.1 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法
    5.2 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法
    5.3 临床样品的检测
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖.  畜牧兽医学报. 2010(08)
[2]实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用[J]. 敖金霞,高学军,仇有文,郭士成.  东北农业大学学报. 2009(06)
[3]猪轮状病毒性腹泻的ELISA双抗夹心法检测及防治建议[J]. 王玲,蒲万霞,孟小琴,邓海平,崔东安,焦硕,杨志强.  安徽农业科学. 2009(05)
[4]猪传染性胃肠炎分子生物学诊断方法研究进展[J]. 徐丽秋,贾赟,刘海防,高玉峰,赵玉军.  中国动物检疫. 2008(08)
[5]水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建[J]. 胡秀华,何苗,刘丽,李丹,施汉昌.  环境科学. 2008(02)
[6]应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒[J]. 杨群,何孔旺,陆承平.  中国预防兽医学报. 2006(04)
[7]应用TGEV N蛋白McAb间接免疫荧光法检测TGEV的研究[J]. 李丹丹,田志军,姜骞,唐丽杰,李一经.  中国兽医杂志. 2006(01)
[8]猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究[J]. 周燕,王建超,华平,邹勇,谭文松.  中国兽医科技. 2005(06)
[9]猪传染性胃肠炎病毒TH-98株在不同细胞增殖特性的研究[J]. 郎景华,李一经,仇波,孙文毅,齐秀清.  黑龙江畜牧兽医. 2003(11)
[10]实时定量PCR技术的介绍[J]. 张立国,张琚.  生物技术. 2003(02)



本文编号：3637026