犬细小病毒VP2基因克隆表达和间接ELISA建立及应用

发布时间：2022-02-21 20:40

　　犬细小病毒病（Canine parvovirus，CPV）在家养和野生的犬科动物传染疾病中，是一种具有高度传染性、致命性的疾病，由CPV引起犬的以剧烈呕吐、便血，带腥臭味水样腹泻、心肌炎、严重脱水为主要症状，以及白细胞显著下降的传染病。本试验针对CPV感染建立了快速PCR诊断法，并应用于临床检测；同时成功地克隆了CPV-VP2基因及对其原核表达，表达的CPV-VP2蛋白纯化、复性后建立了CPV抗体检测间接ELISA法，并初步应用于临床犬只血清中CPV抗体检测。1.根据NBCI已知CPV基因序列，设计引物，以临床可疑CPV感染样品进行PCR扩增，扩增产物经测序分析，结果其与NCBI相关CPV核苷酸同源性在99.8～100%，证实所扩增产物为CPV基因。并对江西农业大学兽医院收治的28例犬可疑CPV感染病例进行了临床应用检测，结果本方法检出率89.28%（25/28），胶体金检测板检测率71.42%（20/28），表明PCR检测技术相对胶体金检测板的灵敏度明显更高。2.根据NBCI已知CPV基因序列，设计CPV VP2基因引物，应用PCR技术扩增出1755bp的VP2基因并克隆至T载体测序... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩写词表
第一章 文献综述
    1.1 犬细小病毒病的病原学
        1.1.1 CPV 的形态特征与理化特点
        1.1.2 CPV 的血凝特性
        1.1.3 CPV 的基因组结构与编码的蛋白
    1.2 犬细小病毒病的发病机理
    1.3 犬细小病毒株的出现以及在它们的分布
    1.4 犬细小病毒病的流行病学
    1.5 临床症状和病理变化
        1.5.1 临床症状
        1.5.2 病理变化
    1.6 犬细小病毒的实验室诊断
        1.6.1 电子显微镜(EM)
        1.6.2 病毒的分离
        1.6.3 血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI）
        1.6.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
        1.6.5 聚合酶链式反应（PCR）
        1.6.6 环介导等温扩增(LAMP)
        1.6.7 核酸测序
    1.7 犬细小病毒病的预防与控制
    1.8 本试验研究目的与意义
第二章 犬细小病毒 PCR 检测方法的建立与应用
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
            2.1.1.1 待检病料
            2.1.1.2 主要生化试剂
            2.1.1.3 主要试剂配制
            2.1.1.4 主要设备
        2.1.2 方法
            2.1.2.1 引物设计与合成
            2.1.2.2 样品DNA的提取
            2.1.2.3 PCR 最佳退火温度条件优化
            2.1.2.4 PCR 扩增片段的测序与分析
            2.1.2.5 PCR 特异性试验
            2.1.2.6 PCR 敏感性试验
            2.1.2.7 临床样品的 PCR 检测
    2.2 结果
        2.2.1 最佳退火温度条件优化
        2.2.2 PCR 扩增片段的测序与分析结果
        2.2.3 PCR 特异性试验结果
        2.2.4 PCR 敏感性试验结果
        2.2.5 临床应用结果
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 犬细小病毒 VP2 基因克隆分析及原核表达
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 试验病料
            3.1.1.2 试验菌种与载体
            3.1.1.3 仪器设备
            3.1.1.4 主要生化试剂
            3.1.1.5 试剂和培养基的配制
            3.1.1.6 抽提质粒缓冲液和溶液的配制
            3.1.1.7 SDS-PAGE 相关试剂配制
            3.1.1.8 蛋白纯化与复性主要试剂的配制
        3.1.2 方法
            3.1.2.1 引物设计
            3.1.2.2 样品 DNA 的提取
            3.1.2.3 VP2 基因的 PCR 扩增
            3.1.2.4 VP2 基因的 PCR 扩增产物纯化
            3.1.2.5 VP2 基因的克隆
            3.1.2.6 重组质粒 pGEM-T-VP2 的小量制备
            3.1.2.7 重组质粒 pGEM-T-VP2 的双酶切鉴定
            3.1.2.8 表达载体 pET32a-VP2 的构建
            3.1.2.9 表达载体 pET32a-VP2 的双酶切鉴定
            3.1.2.10 目的基因 VP2 在 BL21 中的诱导表达
            3.1.2.11 SDS-PAGE 分析
            3.1.2.12 表达条件的优化
            3.1.2.13 表达蛋白的纯化与复性
            3.1.2.14 蛋白浓度的测定
            3.1.2.15 表达 CPV-VP2 蛋白反应性与免疫性的检测
    3.2 结果
        3.2.1 VP2 基因的 PCR 扩增结果
        3.2.2 重组 pGEM-T-VP2 的双酶切鉴定结果
        3.2.3 重组 pGEM-T-VP2 的测序分析结果
            3.2.3.1 VP2 基因核苷酸序列同源性分析结果
            3.2.3.3 VP2 基因分子进化树分析结果
        3.2.4 重组 pET32a-VP2 双酶切鉴定结果
        3.2.5 表达蛋白的 SDS-PAGE 结果
        3.2.6 诱导表达时间的优化结果
        3.2.7 IPTG 诱导浓度的优化结果
        3.2.8 蛋白的表达形式分析结果
        3.2.9 VP2 蛋白的纯化结果
        3.2.10 蛋白浓度的测定结果
        3.2.11 表达 VP2 蛋白反应性的检测
        3.2.12 表达 VP2 蛋白免疫原性的检测
    3.3 讨论
        3.3.1 VP2 基因
        3.3.2 VP2 蛋白
        3.3.3 蛋白纯化与复性
    3.4 小结
第四章 犬细小病毒 VP2 蛋白间接 ELISA 方法的建立与应用
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 试验设备
            4.1.1.2 主要的试剂配制
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 CPV 抗体检测间接 ELISA 相关条件的确定
            4.1.2.2 重复性试验
            4.1.2.3 CPV 间接 ELISA 检测阴、阳性的判定标准
            4.1.2.4 CPV 间接 ELISA 临床应用
    4.2 结果
        4.2.1 表达 VP2 蛋白最佳包被浓度与犬血清最佳稀释倍数的确定
        4.2.2 HPR-羊抗犬 Ig G 浓度的确定
        4.2.3 最佳封闭液的确定
        4.2.4 包被液的确定
        4.2.5 重复性试验
        4.2.6 CPV 间接 ELISA 检测阴、阳性的判定标准
        4.2.7 CPV 间接 ELISA 临床应用
    4.3 讨论
    4.4 小结
全文总结
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用[J]. 陶明江,张祥华,孙明,余恩超,陆家卿,王萍,何后军,邬向东,戴益民.  生物灾害科学. 2013(04)
[2]犬细小病毒病基因工程疫苗的研究进展[J]. 徐进,孙世琪,曹随忠,孙德惠,郭慧琛.  中国兽医科学. 2012(05)
[3]外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略[J]. 钟向阳,石歆莹,周宏灏.  生物工程进展. 2001(06)
[4]细小病毒的分子生物学[J]. 张英.  中国病毒学. 1996(03)
[5]犬细小病毒酶标试剂盒的研制[J]. 刘宏伟,田克恭,渠川玫,时彦胜,王树勤,符兆英.  中国畜禽传染病. 1994(06)
[6]某犬群爆发犬病毒性肠炎的流行病学和临床病理学观察[J]. 徐汉坤,金淮,郭宝发,赖杰.  畜牧与兽医. 1983(05)

硕士论文
[1]北京地区犬细小病毒病的分子流行病学调查研究[D]. 柏丽华.中国农业科学院 2011



本文编号：3638005