猪圆环病毒2型Rep和Rep’蛋白的表达及其免疫学特性的研究

发布时间：2022-02-23 19:23

　　猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科，圆环病毒属成员，分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1不引起猪发病；PCV2被证明是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PCV2基因组主要包括2个大的阅读框架（ORFs），ORF1基因编码病毒复制酶（Rep/Rep’），ORF2基因编码病毒核衣壳蛋白（Cap）。Cap蛋白能够诱导机体产生免疫应答，产生抗PCV2的中和性抗体，是分子诊断方法的建立及亚单位疫苗制备的理想靶抗原。自然感染PCV2可同时产生Cap与Rep/Rep’抗体。因此，对Rep/Rep’蛋白免疫特性了解及其自然感染与疫苗免疫间鉴别诊断尤为重要。为了阐明PCV2Rep/Rep’蛋白的免疫学特性，采用杆状病毒系统表达了PCV2-Rep和PCV2-Rep’重组蛋白，用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，评价该蛋白的免疫原性及其免疫保护性；利用杂交瘤细胞技术制备抗PCV2-Rep’蛋白单克隆抗体，以多肽扫描技术鉴定了该单抗对应的抗原核心表位区。本研究为PCV2-Rep/Rep’蛋白免疫特性、抗原表位分析及其鉴别诊断技术的研究奠定了基础。为... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省211工程院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

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目录
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 PCV2 病原学
        1.1.1 病毒的分类
        1.1.2 病毒的结构及理化特性
        1.1.3 病毒的基因组结构
        1.1.4 病毒的培养特性
    1.2 PCV 分子生物学
        1.2.1 病毒的复制与转录
        1.2.2 病毒编码的主要蛋白
    1.3 引起疾病的临床症状
        1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征的临床症状
        1.3.2 猪皮炎肾病综合征的临床症状
        1.3.3 猪呼吸道疾病综合征
        1.3.4 母猪繁殖障碍
    1.4 PCV2 流行病学
        1.4.1 传播途径
        1.4.2 易感动物及宿主
    1.5 PCV2 免疫抑制机理的研究
        1.5.1 PCV2 对树突状细胞的影响
        1.5.2 PCV2 对单核/巨噬细胞的影响（MLCs）
        1.5.3 PCV2 对细胞因子变化的影响
    1.6 病毒诊断技术的研究进展
        1.6.1 病原学诊断技术
        1.6.2 血清学诊断技术
    1.7 疫苗的研究进展
        1.7.1 PCV2 灭活疫苗
        1.7.2 PCV2 弱毒疫苗
        1.7.3 PCV2 亚单位疫苗
    1.8 目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 毒株和细胞与抗体
        2.1.2 质粒和菌株
        2.1.3 实验动物
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 Rep 和 Rep’基因克隆
        2.2.2 重组病毒拯救
        2.2.3 病毒蚀斑克隆
        2.2.4 重组蛋白表达
        2.2.5 重组蛋白反应活性鉴定
        2.2.6 重组蛋白纯化
        2.2.7 重组蛋白免疫原性鉴定测定
        2.2.8 重组蛋白的表达与纯化
        2.2.9 动物免疫与细胞融合
        2.2.10 MAb 亚类鉴定及腹水制备
        2.2.11 MAb 反应活性鉴定
        2.2.12 MAb 抗原交叉反应鉴定
        2.2.13 合成肽法抗原识别表位初步定位
        2.2.14 肽扫描法抗原识别表位精确定位
        2.2.15 重组蛋白亚单位疫苗的制备
        2.2.16 动物免疫与攻毒试验
        2.2.17 免疫血清抗体的测定
        2.2.18 血清中和试验
        2.2.19 常规与荧光定量 PCR
        2.2.20 组织病理学检验
3 结果
    3.1 基因克隆与测序
    3.2 重组病毒蚀斑克隆
    3.3 重组病毒繁殖特性
    3.4 Rep 蛋白表达及反应原性鉴定
    3.5 Rep’蛋白表达及反应原性鉴定
    3.6 重组蛋白的纯化
    3.7 Rep 和 Rep’蛋白免疫原性测定
    3.8 PCV2 感染细胞中 Rep 和 Rep’蛋白检测
    3.9 MAb 筛选及亚类鉴定
    3.10 MAb 反应原性鉴定
    3.11 MAb 特异性鉴定
    3.12 抗原识别表位的初步定位
    3.13 抗原识别表位的精确定位
    3.14 PCV2-rCap、-Rep 和 Rep’蛋白免疫鼠抗体测定
    3.15 PCV2-rCap、-Rep 和 Rep’免疫鼠中和抗体测定
    3.16 PCV2-rCap、-Rep 和 Rep’免疫鼠攻毒后病毒血症测定
    3.17 PCV2-rCap、-Rep 和 Rep’免疫鼠攻毒后肺脏病毒载量测定
    3.18 PCV2-rCap、-Rep 和 Rep’免疫鼠攻毒后肺脏组织病理观察
4 讨论
    4.1 PCV2-Rep 和-Rep’蛋白表达及其免疫原性
    4.2 PCV2-Rep’蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定
    4.3 PCV2-Rep 和-Rep’和 Cap 蛋白免疫保护性研究
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒疫苗的研究进展[J]. 刘长明,陆月华,郭龙军,危艳武.  兽医导刊. 2012(02)
[2]猪圆环病毒2a/2b亚型病毒株灭活疫苗及其重组Cap蛋白亚单位疫苗的交互免疫实验[J]. 付玉洁,郭龙军,黄立平,危艳武,唐青海,吴洪丽,刘长明.  中国预防兽医学报. 2012(02)
[3]猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）的研制与应用[J]. 刘长明,危艳武,陆月华,黄立平,吴洪丽,张朝霞,温士刚,姜凤娟.  畜牧兽医科技信息. 2010(09)
[4]抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 黄立平,刘长明,危艳武,张朝霞,陆月华,郭龙军.  中国预防兽医学报. 2009(02)
[5]猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用[J]. 张朝霞,刘长明,危艳武,袁婧,黄立平.  中国预防兽医学报. 2008(07)
[6]猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J]. 刘长明,张超范,危艳武,张朝霞,袁婧.  中国预防兽医学报. 2007(08)
[7]猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J]. 刘长明,张超范,危艳武,谭斌,陆月华,谷守林.  中国预防兽医学报. 2006(03)
[8]猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达[J]. 刘长明,陆月华,张超范,危艳武,刘焕章,童光志.  中国预防兽医学报. 2005(06)



本文编号：3641203