基于IGPD靶标探讨头孢喹肟干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制
发布时间：2022-02-24 15:30
奶牛乳房炎对奶牛业危害严重,在近年临床调查中,隐性奶牛乳房炎造成的经济损失正在逐年增加,而木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus,S.xylosus）是隐性奶牛乳房炎重要的机会致病菌,当其形成生物被膜（biofilm,BF）后,其耐药性明显增强,且逃避宿主免疫清除作用,导致持续性感染,造成疾病迁延不愈。因此,对木糖葡萄球菌生物被膜调控机制的研究,寻找新型药物作用靶标,已成为当前研究工作的热点之一。头孢喹肟（Cefquinome）是目前唯一的动物专用第四代头孢类抗生素,具有抗菌谱广、抗菌活性强等特点,虽然头孢喹肟能够干预金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,但目前尚未见头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜形成的作用及其作用机制的研究,因此本研究通过蛋白质组学iTRAQ技术,在亚抑菌浓度的头孢喹肟干预下筛选木糖葡萄球菌生物被膜形成的差异蛋白,寻找头孢喹肟可能的作用蛋白靶标,经过生物信息学分析,初步确定潜在的作用靶标是咪唑甘油磷酸酯脱水酶（Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase,IGPD）（A0A068E9J3）。在此基础上,采用基因敲除及互补技...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
1.1 细菌生物被膜研究进展
1.1.1 细菌生物被膜简介
1.1.2 细菌生物被膜的形成
1.1.3 细菌生物被膜的信号调节
1.1.4 凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)生物被膜形成的分子机制
1.1.5 干预细菌生物被膜形成的策略
1.2 头孢菌素及头孢喹肟影响生物被膜形成的研究进展
1.2.1 头孢菌素及头孢喹肟简介
1.2.2 头孢菌素及头孢喹肟对生物被膜的影响
1.3 咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD)及组氨酸研究进展
1.3.1 咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD)简介
1.3.2 IGPD分子结构
1.3.3 IGPD抑制剂
1.3.4 L-组氨酸简介
1.3.5 IGPD及组氨酸影响生物被膜形成
1.4 研究目的与意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 药品
2.1.3 培养基及试剂
2.1.4 仪器设备
2.1.5 PCR引物
2.2 方法
2.2.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的抑菌作用
2.2.2 木糖葡萄球菌生物被膜培养及形成能力测定
2.2.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
2.2.4 1/2MIC头孢喹肟干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白质组学研究
2.2.5 木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株及回补株的构建
2.2.6 头孢喹肟对hisB基因缺失株和野生株IGPD及组氨酸的影响
2.2.7 IGPD的同源建模及与头孢喹肟结合位点的预测
2.2.8 IGPD与头孢喹肟相互作用的验证
3 结果与分析
3.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的抑菌作用
3.2 亚抑菌浓度头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜形成的干预作用
3.2.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的影响
3.2.2 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜形态的影响
3.3 亚抑菌浓度头孢喹肟干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白组学研究
3.3.1 蛋白质鉴定结果
3.3.2 生物信息学分析
3.4 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株及回补株的构建
3.4.1 PCR扩增木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上下游同源臂
3.4.2 PCR扩增ermB基因
3.4.3 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上游同源臂测序比对结果
3.4.4 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的下游同源臂测序比对结果
3.4.5 ermB基因测序比对结果
3.4.6 自杀质粒的PCR鉴定
3.4.7 自杀质粒上木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上游同源臂测序比对结果
3.4.8 自杀质粒上木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的下游同源臂测序比对结果
3.4.9 自杀质粒上ermB基因测序比对结果
3.4.10 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株的PCR鉴定
3.4.11 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因回补株的PCR鉴定
3.5 头孢喹肟对木糖葡萄球菌hisB基因缺失菌株和野生菌株IGPD及组氨酸的影响
3.5.1 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株生物被膜形成能力的测定
3.5.2 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因回补株生物被膜形成能力的测定
3.5.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌ATCC 700404 IGPD活性的影响
3.5.4 头孢喹肟对木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株及野生株组氨酸含量的影响
3.6 IGPD与头孢喹肟结合位点的预测
3.6.1 IGPD的同源建模及验证
3.6.2 IGPD与头孢喹肟靶点预测
3.7 IGPD与头孢喹肟相互作用的验证
3.7.1 IGPD及突变蛋白的表达和纯化
3.7.2 BIAcore检测IGPD与头孢喹肟相互作用
3.7.3 IGPD突变蛋白与头孢喹肟相互作用
4 讨论
4.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的作用
4.2 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
4.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的蛋白组学分析
4.4 组氨酸代谢及IGPD对于木糖葡萄球菌生物被膜的形成发挥重要作用
4.5 IGPD是头孢喹肟的潜在靶标
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定[J]. 包玎,李伟,石乐明,李全贞. 生物工程学报. 2017(12)
[2]定量PCR和Western blot结合检测回药爱康方对肺癌细胞EGFR、NF-κB的表达影响[J]. 马科,陈丽军,姬秀娥,戴永福,陈文,孙媛,林颖. 中华中医药学刊. 2016(12)
[3]鸡白痢沙门菌SpiC蛋白的原核表达及其应用[J]. 耿士忠,刘欢,焦新安,潘志明,钱珊珊,郭荣显,安树敏,薛颖. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(02)
[4]咪唑甘油磷酸酯脱水酶与含氮杂环磷酸酯类抑制剂作用方式的分子模拟[J]. 申涛,杜凤沛,刘婷,姚广伟,吴峥,方萌萌,徐筱杰,路慧哲. 物理化学学报. 2011(08)
[5]咪唑甘油磷酸酯脱水酶及其抑制剂的研究进展[J]. 肖勇军,王建国,何凤琦,李正名. 农药. 2005(10)
[6]组氨酸含量测定方法探讨[J]. 李继珩,孙晓艳. 氨基酸杂志. 1986(02)
博士论文
[1]基于谷氨酰胺合成酶靶标探讨红霉素干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制[D]. 杨艳北.东北农业大学 2017
硕士论文
[1]猪ISG43和ISG60蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[D]. 姜炳星.广西大学 2017
本文编号：3643010
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
1.1 细菌生物被膜研究进展
1.1.1 细菌生物被膜简介
1.1.2 细菌生物被膜的形成
1.1.3 细菌生物被膜的信号调节
1.1.4 凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)生物被膜形成的分子机制
1.1.5 干预细菌生物被膜形成的策略
1.2 头孢菌素及头孢喹肟影响生物被膜形成的研究进展
1.2.1 头孢菌素及头孢喹肟简介
1.2.2 头孢菌素及头孢喹肟对生物被膜的影响
1.3 咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD)及组氨酸研究进展
1.3.1 咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD)简介
1.3.2 IGPD分子结构
1.3.3 IGPD抑制剂
1.3.4 L-组氨酸简介
1.3.5 IGPD及组氨酸影响生物被膜形成
1.4 研究目的与意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 药品
2.1.3 培养基及试剂
2.1.4 仪器设备
2.1.5 PCR引物
2.2 方法
2.2.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的抑菌作用
2.2.2 木糖葡萄球菌生物被膜培养及形成能力测定
2.2.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
2.2.4 1/2MIC头孢喹肟干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白质组学研究
2.2.5 木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株及回补株的构建
2.2.6 头孢喹肟对hisB基因缺失株和野生株IGPD及组氨酸的影响
2.2.7 IGPD的同源建模及与头孢喹肟结合位点的预测
2.2.8 IGPD与头孢喹肟相互作用的验证
3 结果与分析
3.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的抑菌作用
3.2 亚抑菌浓度头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜形成的干预作用
3.2.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的影响
3.2.2 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜形态的影响
3.3 亚抑菌浓度头孢喹肟干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白组学研究
3.3.1 蛋白质鉴定结果
3.3.2 生物信息学分析
3.4 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株及回补株的构建
3.4.1 PCR扩增木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上下游同源臂
3.4.2 PCR扩增ermB基因
3.4.3 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上游同源臂测序比对结果
3.4.4 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的下游同源臂测序比对结果
3.4.5 ermB基因测序比对结果
3.4.6 自杀质粒的PCR鉴定
3.4.7 自杀质粒上木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的上游同源臂测序比对结果
3.4.8 自杀质粒上木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因的下游同源臂测序比对结果
3.4.9 自杀质粒上ermB基因测序比对结果
3.4.10 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株的PCR鉴定
3.4.11 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因回补株的PCR鉴定
3.5 头孢喹肟对木糖葡萄球菌hisB基因缺失菌株和野生菌株IGPD及组氨酸的影响
3.5.1 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株生物被膜形成能力的测定
3.5.2 木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因回补株生物被膜形成能力的测定
3.5.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌ATCC 700404 IGPD活性的影响
3.5.4 头孢喹肟对木糖葡萄球菌ATCC 700404 hisB基因缺失株及野生株组氨酸含量的影响
3.6 IGPD与头孢喹肟结合位点的预测
3.6.1 IGPD的同源建模及验证
3.6.2 IGPD与头孢喹肟靶点预测
3.7 IGPD与头孢喹肟相互作用的验证
3.7.1 IGPD及突变蛋白的表达和纯化
3.7.2 BIAcore检测IGPD与头孢喹肟相互作用
3.7.3 IGPD突变蛋白与头孢喹肟相互作用
4 讨论
4.1 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的作用
4.2 头孢喹肟对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
4.3 头孢喹肟对木糖葡萄球菌的蛋白组学分析
4.4 组氨酸代谢及IGPD对于木糖葡萄球菌生物被膜的形成发挥重要作用
4.5 IGPD是头孢喹肟的潜在靶标
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定[J]. 包玎,李伟,石乐明,李全贞. 生物工程学报. 2017(12)
[2]定量PCR和Western blot结合检测回药爱康方对肺癌细胞EGFR、NF-κB的表达影响[J]. 马科,陈丽军,姬秀娥,戴永福,陈文,孙媛,林颖. 中华中医药学刊. 2016(12)
[3]鸡白痢沙门菌SpiC蛋白的原核表达及其应用[J]. 耿士忠,刘欢,焦新安,潘志明,钱珊珊,郭荣显,安树敏,薛颖. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(02)
[4]咪唑甘油磷酸酯脱水酶与含氮杂环磷酸酯类抑制剂作用方式的分子模拟[J]. 申涛,杜凤沛,刘婷,姚广伟,吴峥,方萌萌,徐筱杰,路慧哲. 物理化学学报. 2011(08)
[5]咪唑甘油磷酸酯脱水酶及其抑制剂的研究进展[J]. 肖勇军,王建国,何凤琦,李正名. 农药. 2005(10)
[6]组氨酸含量测定方法探讨[J]. 李继珩,孙晓艳. 氨基酸杂志. 1986(02)
博士论文
[1]基于谷氨酰胺合成酶靶标探讨红霉素干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制[D]. 杨艳北.东北农业大学 2017
硕士论文
[1]猪ISG43和ISG60蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[D]. 姜炳星.广西大学 2017
本文编号：3643010
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