猪圆环病毒2型Cap蛋白与重组单链抗体APCH1的融合表达及其免疫原性研究
发布时间：2022-02-26 06:02
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是严重危害我国养猪业的重要病原之一。目前对PCV2的防控以疫苗免疫为主,市场上商品化PCV2疫苗有很多,其中大多数疫苗需要添加佐剂来提高免疫效应,传统佐剂因其具有强大的免疫功效得到广泛的应用,但同时也会引起一些毒副反应,对机体产生潜在的健康风险。近来,有研究显示APCH1（Antigen presenting cells homing 1）重组单链抗体可以携带抗原靶向至抗原呈递细胞（APCs）,并与主要组织相容性复合体II类分子（MHCII）的抗原位点结合,形成抗原肽-MHCII分子复合物,然后转运至APCs表面供T淋巴细胞受体（TCR）识别,从而显著增强亚单位疫苗的免疫效果。鉴于此,本研究利用杆状病毒表达载体系统,将APCH1与PCV2 Cap蛋白进行融合表达,构建了具有分子佐剂活性的PCV2亚单位基因工程疫苗,并在动物体内对所构建的疫苗进行了免疫效力评价。主要研究内容如下:1.重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及体外表达人工合成重组单链抗体APCH1基因以及昆虫细胞密码子优化的PCV2 ORF2...
【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪圆环病毒2型的分子生物学特性
1.1.1 猪圆环病毒2型的病原特征
1.1.2 PCV2基因组结构及编码蛋白
1.1.3 PCV2免疫原性蛋白的结构特点
1.1.4 猪圆环病毒2型致病机理
1.2 猪圆环病毒疫苗的研究进展
1.2.1 全病毒灭活疫苗
1.2.2 亚单位基因工程疫苗
1.2.3 重组活载体疫苗
1.2.4 核酸疫苗
1.3 分子佐剂
1.4 杆状病毒表达系统
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞和菌株
3.1.2 载体、质粒和引物
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 其它缓冲液及试剂
3.1.8 实验动物
3.2 实验方法
3.2.1 PCV2的增殖
3.2.2 限制性内切酶酶切反应
3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.4 酶切产物回收与纯化
3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.7 连接产物的转化
3.2.8 质粒的制备与鉴定
3.2.9 质粒DNA浓度的测定
3.2.10 重组Bacmid DNA的提取
3.2.11 重组杆状病毒的制备
3.2.12 Western blot试验
3.2.13 间接免疫荧光试验(IFA)
3.2.14 微量中和试验
3.2.15 间接ELISA
3.2.16 饲养细胞的准备
3.2.17 骨髓瘤细胞的复苏活化及融合用骨髓瘤细胞的制备
3.2.18 细胞融合
3.2.19 阳性细胞孔的筛选
3.2.20 阳性细胞的克隆
3.2.21 单克隆抗体的大量制备
3.2.22 抗体的纯化
3.2.23 过碘酸钠氧化法制备HRP标记的单抗
3.2.24 细胞免疫的检测
3.2.25 小鼠的免疫与攻毒保护性试验
3.2.26 组织病理变化分析
3.2.27 统计学方法
第四章 结果与分析
4.1 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及融合蛋白的表达
4.1.1 重组质粒pFastBac Dual-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.2 重组质粒pFastBac Dual-D-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.3 穿梭质粒Bacmid-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.4 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的制备
4.1.5 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的纯化与滴度测定
4.1.6 间接免疫荧光试验(IFA)检测重组蛋白的表达
4.1.7 Western blot检测重组蛋白的表达
4.2 猪圆环病毒2型Cap蛋白定量检测方法的建立
4.2.1 重组转移质粒pFastBacDual-D-GP64SP-△ORF2-His的构建
4.2.2 重组杆状病毒rBV-D-Cap-His目的蛋白的表达
4.2.3 抗原标准品的纯化
4.2.4 PCV2Cap蛋白单克隆抗体的制备及相关特性检测
4.2.5 双抗夹心ELISA定量检测Cap蛋白方法的建立
4.2.6 重组目的蛋白APCH1-Cap和Cap的制备及定量
4.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱发的免疫保护
4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平
4.3.2 免疫小鼠的中和抗体水平
4.3.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖检测
4.3.4 免疫小鼠淋巴细胞增殖的FCM检测分析
4.3.5 免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子水平分析
4.3.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达
4.3.7 攻毒后小鼠的组织病理变化
第五章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 双抗夹心ELISA定量检测免疫原性蛋白
5.1.2 APCH1分子佐剂诱导体液免疫和细胞免疫的可能机制
5.1.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱导的保护性免疫
5.2 结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型疫苗与猪支原体肺炎疫苗混合免疫效果评价[J]. 赵海忠,李良华,王德才,宋忠旭,彭先文,梅书棋. 畜牧与兽医. 2019(03)
[2]猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达[J]. 沈克飞,杨柳,杨睿,周雪,张素辉,付利芝. 中国生物制品学杂志. 2019(01)
[3]2017～2018年华中地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析[J]. 邓文芳,宋文博,胡星星,贾双,陈翔鸿,喻红艳,汤细彪. 中国动物传染病学报. 2020(02)
[4]四种常用化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果研究[J]. 储玉双,李红英,黄小红. 湖北畜牧兽医. 2018(12)
[5]国内商品化猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法之比较[J]. 何天慈,万建青,邹兴启,李翠,朱元源,徐嫄,赵启祖. 中国兽医杂志. 2018(11)
[6]猪圆环病毒2型疫苗的研究与应用[J]. 靳立明. 养殖与饲料. 2018(11)
[7]猪圆环病毒研究进展[J]. 何小莉,梁海英,曾智勇,汤德元,王彬,黄涛,徐国,叶百川,咸文,张爱琼,陈娟,吴好叶. 猪业科学. 2018(09)
[8]猪圆环病毒2型疫苗的研究进展[J]. 张爱琼,梁海英,曾智勇,汤德元,王彬,黄涛,徐国,叶百川,咸文,何小莉. 黑龙江畜牧兽医. 2018(11)
[9]兽用疫苗佐剂的研究进展[J]. 邓碧华,朱俊,马鹤毓,徐海,卢宇. 畜牧兽医科学(电子版). 2017(12)
[10]猪圆环病毒基因组结构与功能研究进展[J]. 代振江,王伟丞,曾智勇,汤德元,梁海英,刘钊,徐国,叶百川. 畜牧与兽医. 2016(03)
博士论文
[1]壳寡糖修饰猪圆环病毒疫苗的免疫原性及作用机制研究[D]. 张贵强.中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所) 2018
[2]核定位信号肽介导猪圆环病毒2型Cap蛋白出核机制的研究[D]. 侯强.中国农业科学院 2018
[3]人感染圆环病毒的血清流行病学研究及新型抗圆环病毒疫苗的研制[D]. 于澄.吉林大学 2017
[4]PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究[D]. 孙文超.广西大学 2017
[5]靶向DEC-205的猪圆环病毒Capsid疫苗的设计及其免疫应答研究[D]. 潘玉竹.重庆大学 2014
[6]泛素蛋白酶体途径在猪圆环病毒2型体外感染中的作用研究[D]. 程爽.华中农业大学 2014
[7]猪圆环病毒2型Cap蛋白的家蚕表达及亚单位疫苗在小鼠和仔猪的免疫效力试验[D]. 郎洪武.中国农业大学 2013
[8]猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究[D]. 尹双辉.中国农业科学院 2011
[9]猪圆环病毒2型的检测及皂苷类化合物对核酸疫苗的免疫增强作用[D]. 杨宗照.浙江大学 2008
[10]猪圆环病毒Ⅱ对猪的实验性感染及其Cap蛋白诱导的小鼠免疫应答类型[D]. 申会刚.浙江大学 2007
硕士论文
[1]PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的初步研究[D]. 刘国阳.安徽农业大学 2018
[2]表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 谢永兴.中国农业科学院 2018
[3]重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析[D]. 张艳艳.吉林农业大学 2018
[4]杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及其免疫原性的研究[D]. 刘小康.浙江理工大学 2018
[5]PCV2感染对小鼠肠道黏膜免疫的影响[D]. 刘沅.湖南农业大学 2017
[6]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价[D]. 孙博.东北农业大学 2017
[7]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建和鉴定[D]. 张玲楷.中国农业科学院 2017
[8]PCV2单克隆抗体的制备及多拷贝P28-ORF2重组猪痘病毒的构建[D]. 薛瑞.江西农业大学 2017
[9]携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建[D]. 代振江.贵州大学 2017
[10]猪圆环病毒Ⅱ型Capsid表面Loop BC的结构与功能研究[D]. 刘思远.湖南农业大学 2017
本文编号：3644143
【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪圆环病毒2型的分子生物学特性
1.1.1 猪圆环病毒2型的病原特征
1.1.2 PCV2基因组结构及编码蛋白
1.1.3 PCV2免疫原性蛋白的结构特点
1.1.4 猪圆环病毒2型致病机理
1.2 猪圆环病毒疫苗的研究进展
1.2.1 全病毒灭活疫苗
1.2.2 亚单位基因工程疫苗
1.2.3 重组活载体疫苗
1.2.4 核酸疫苗
1.3 分子佐剂
1.4 杆状病毒表达系统
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞和菌株
3.1.2 载体、质粒和引物
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 其它缓冲液及试剂
3.1.8 实验动物
3.2 实验方法
3.2.1 PCV2的增殖
3.2.2 限制性内切酶酶切反应
3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.4 酶切产物回收与纯化
3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.7 连接产物的转化
3.2.8 质粒的制备与鉴定
3.2.9 质粒DNA浓度的测定
3.2.10 重组Bacmid DNA的提取
3.2.11 重组杆状病毒的制备
3.2.12 Western blot试验
3.2.13 间接免疫荧光试验(IFA)
3.2.14 微量中和试验
3.2.15 间接ELISA
3.2.16 饲养细胞的准备
3.2.17 骨髓瘤细胞的复苏活化及融合用骨髓瘤细胞的制备
3.2.18 细胞融合
3.2.19 阳性细胞孔的筛选
3.2.20 阳性细胞的克隆
3.2.21 单克隆抗体的大量制备
3.2.22 抗体的纯化
3.2.23 过碘酸钠氧化法制备HRP标记的单抗
3.2.24 细胞免疫的检测
3.2.25 小鼠的免疫与攻毒保护性试验
3.2.26 组织病理变化分析
3.2.27 统计学方法
第四章 结果与分析
4.1 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及融合蛋白的表达
4.1.1 重组质粒pFastBac Dual-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.2 重组质粒pFastBac Dual-D-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.3 穿梭质粒Bacmid-APCH1-△41ORF2的构建
4.1.4 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的制备
4.1.5 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的纯化与滴度测定
4.1.6 间接免疫荧光试验(IFA)检测重组蛋白的表达
4.1.7 Western blot检测重组蛋白的表达
4.2 猪圆环病毒2型Cap蛋白定量检测方法的建立
4.2.1 重组转移质粒pFastBacDual-D-GP64SP-△ORF2-His的构建
4.2.2 重组杆状病毒rBV-D-Cap-His目的蛋白的表达
4.2.3 抗原标准品的纯化
4.2.4 PCV2Cap蛋白单克隆抗体的制备及相关特性检测
4.2.5 双抗夹心ELISA定量检测Cap蛋白方法的建立
4.2.6 重组目的蛋白APCH1-Cap和Cap的制备及定量
4.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱发的免疫保护
4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平
4.3.2 免疫小鼠的中和抗体水平
4.3.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖检测
4.3.4 免疫小鼠淋巴细胞增殖的FCM检测分析
4.3.5 免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子水平分析
4.3.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达
4.3.7 攻毒后小鼠的组织病理变化
第五章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 双抗夹心ELISA定量检测免疫原性蛋白
5.1.2 APCH1分子佐剂诱导体液免疫和细胞免疫的可能机制
5.1.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱导的保护性免疫
5.2 结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型疫苗与猪支原体肺炎疫苗混合免疫效果评价[J]. 赵海忠,李良华,王德才,宋忠旭,彭先文,梅书棋. 畜牧与兽医. 2019(03)
[2]猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达[J]. 沈克飞,杨柳,杨睿,周雪,张素辉,付利芝. 中国生物制品学杂志. 2019(01)
[3]2017～2018年华中地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析[J]. 邓文芳,宋文博,胡星星,贾双,陈翔鸿,喻红艳,汤细彪. 中国动物传染病学报. 2020(02)
[4]四种常用化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果研究[J]. 储玉双,李红英,黄小红. 湖北畜牧兽医. 2018(12)
[5]国内商品化猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法之比较[J]. 何天慈,万建青,邹兴启,李翠,朱元源,徐嫄,赵启祖. 中国兽医杂志. 2018(11)
[6]猪圆环病毒2型疫苗的研究与应用[J]. 靳立明. 养殖与饲料. 2018(11)
[7]猪圆环病毒研究进展[J]. 何小莉,梁海英,曾智勇,汤德元,王彬,黄涛,徐国,叶百川,咸文,张爱琼,陈娟,吴好叶. 猪业科学. 2018(09)
[8]猪圆环病毒2型疫苗的研究进展[J]. 张爱琼,梁海英,曾智勇,汤德元,王彬,黄涛,徐国,叶百川,咸文,何小莉. 黑龙江畜牧兽医. 2018(11)
[9]兽用疫苗佐剂的研究进展[J]. 邓碧华,朱俊,马鹤毓,徐海,卢宇. 畜牧兽医科学(电子版). 2017(12)
[10]猪圆环病毒基因组结构与功能研究进展[J]. 代振江,王伟丞,曾智勇,汤德元,梁海英,刘钊,徐国,叶百川. 畜牧与兽医. 2016(03)
博士论文
[1]壳寡糖修饰猪圆环病毒疫苗的免疫原性及作用机制研究[D]. 张贵强.中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所) 2018
[2]核定位信号肽介导猪圆环病毒2型Cap蛋白出核机制的研究[D]. 侯强.中国农业科学院 2018
[3]人感染圆环病毒的血清流行病学研究及新型抗圆环病毒疫苗的研制[D]. 于澄.吉林大学 2017
[4]PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究[D]. 孙文超.广西大学 2017
[5]靶向DEC-205的猪圆环病毒Capsid疫苗的设计及其免疫应答研究[D]. 潘玉竹.重庆大学 2014
[6]泛素蛋白酶体途径在猪圆环病毒2型体外感染中的作用研究[D]. 程爽.华中农业大学 2014
[7]猪圆环病毒2型Cap蛋白的家蚕表达及亚单位疫苗在小鼠和仔猪的免疫效力试验[D]. 郎洪武.中国农业大学 2013
[8]猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究[D]. 尹双辉.中国农业科学院 2011
[9]猪圆环病毒2型的检测及皂苷类化合物对核酸疫苗的免疫增强作用[D]. 杨宗照.浙江大学 2008
[10]猪圆环病毒Ⅱ对猪的实验性感染及其Cap蛋白诱导的小鼠免疫应答类型[D]. 申会刚.浙江大学 2007
硕士论文
[1]PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的初步研究[D]. 刘国阳.安徽农业大学 2018
[2]表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 谢永兴.中国农业科学院 2018
[3]重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析[D]. 张艳艳.吉林农业大学 2018
[4]杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及其免疫原性的研究[D]. 刘小康.浙江理工大学 2018
[5]PCV2感染对小鼠肠道黏膜免疫的影响[D]. 刘沅.湖南农业大学 2017
[6]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价[D]. 孙博.东北农业大学 2017
[7]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建和鉴定[D]. 张玲楷.中国农业科学院 2017
[8]PCV2单克隆抗体的制备及多拷贝P28-ORF2重组猪痘病毒的构建[D]. 薛瑞.江西农业大学 2017
[9]携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建[D]. 代振江.贵州大学 2017
[10]猪圆环病毒Ⅱ型Capsid表面Loop BC的结构与功能研究[D]. 刘思远.湖南农业大学 2017
本文编号：3644143
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