禽流感病毒LAMP检测方法的建立及初步应用
发布时间：2022-04-16 08:37
禽流感是危害养禽业的主要疫病，尤其是H9亚型低致病性禽流感病毒。由于该病毒感染一般不会造成禽类的大量死亡，只引起比较轻微的呼吸道症状，跟禽类其它的呼吸道疾病极为相似，因此具有极大的隐蔽性和欺骗性，更容易在鸡群中蔓延。鉴于此，建立H9亚型低致病性禽流感的诊断方法就显得格外重要。目前，禽流感的主要诊断方法为病毒分离、血凝及血凝抑制试验、RT-PCR等，这些方法耗时长、操作复杂，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增方法，该方法仅需一个简单的恒温装置，在几十分钟内就能够完成核酸扩增反应。其最重要的特点就是扩增效率极高，反应时间也较短，且可以靠直接观察扩增产物产生的沉淀来观察扩增的结果。与传统的PCR方法相比LAMP方法不需要复杂的温度变化，长时间的温度循环，以及琼脂糖凝胶电泳紫外观察等复杂过程，LAMP检测方法很适合进行基层部门的快速检测。本研究建立了H9亚型禽流感病毒的LAMP检测方法并进行了初步应用，主要内容包括：1.本研究参考禽流感病毒的基质...
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 禽流感的概述
1.1.1 禽流感的病原学
1.1.2 禽流感的流行病学
1.1.3 禽流感的危害
1.1.4 禽流感疫情
1.1.5 公共卫生学
1.1.6 禽流感的预防
1.1.7 禽流感诊断检测技术进展
1.2 环介导等温扩增(LAMP)检测方法的概述
1.2.1 LAMP 反应引物的设计
1.2.2 LAMP 反应的原理
1.2.3 LAMP 反应结果的判定
1.2.4 LAMP 检测方法的实践应用
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒
2.1.2 实验动物
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.1.5 主要溶液及培养基的配制
2.2 方法
2.2.1 LAMP 反应的初步建立
2.2.2 H9 亚型禽流感病毒的排毒规律
2.2.3 对排毒毒株的克隆测序分析
3 结果与分析
3.1 LAMP 反应的初步建立
3.1.1 LAMP 反应体系的初步建立
3.1.2 LAMP 引物的选取
3.1.3 LAMP 反应温度的确定
3.1.4 LAMP 反应的敏感性试验
3.1.5 LAMP 反应的特异性试验
3.2 排毒规律试验结果
3.2.1 各个毒株的血凝价
3.2.2 第一次攻毒试验
3.2.3 测定病毒的 EID50
3.2.4 攻毒试验
3.2.5 排毒情况
3.2.6 对排毒试验棉拭子样品的检测
3.3 对排毒毒株的克隆测序
3.3.1 RT-PCR 结果
3.3.2 病毒的克隆测序
3.3.3 序列分析
4 讨论
4.1 LAMP 反应的初步建立
4.2 H9 亚型禽流感病毒的排毒规律
结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽流感病毒跨种传播机制的研究进展[J]. 许晨. 科学. 2012(01)
[2]建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法[J]. 王秋泉,黄平,胡守旺,高秀洁,杨杏芬,李杰. 第三军医大学学报. 2010(03)
[3]环介导恒温扩增法（LAMP）检测金黄色葡萄球菌[J]. 李永刚,王德国,武建刚,霍贵成. 食品工业科技. 2010(01)
[4]猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 鑫婷,侯绍华,贾红,郭晓宇,丁家波,李延鹏,丁敏,朱鸿飞. 中国农业科学. 2010(01)
[5]高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立[J]. 黄平,胡守旺,王秋泉,杨杏芬,高秀洁,李杰. 第四军医大学学报. 2009(23)
[6]猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立[J]. 张兴娟,孙元,刘大飞,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2009(11)
[7]LAMP检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究[J]. 袁耀武,张亚爽,马晓燕,张伟. 中国食品学报. 2009(03)
[8]禽流感病毒分型基因芯片的研制[J]. 韩雪清,林祥梅,侯义宏,吴绍强,刘建,梅琳,贾广乐,杨泽晓. 微生物学报. 2008(09)
[9]H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较[J]. 白泉阳,孙颖杰,郑腾,张伯强,赵兴存,王武军,张志灯,张体银. 福建农业学报. 2008(02)
[10]口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 秦智锋,曾少灵,阮周曦,陈兵,曹琛福,花群义,吕建强,叶奕优,范万红,毕英佐. 中国预防兽医学报. 2008(05)
硕士论文
[1]环介导等温核酸扩增（LAMP）技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究[D]. 胡连霞.河北农业大学 2009
本文编号：3645947
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 禽流感的概述
1.1.1 禽流感的病原学
1.1.2 禽流感的流行病学
1.1.3 禽流感的危害
1.1.4 禽流感疫情
1.1.5 公共卫生学
1.1.6 禽流感的预防
1.1.7 禽流感诊断检测技术进展
1.2 环介导等温扩增(LAMP)检测方法的概述
1.2.1 LAMP 反应引物的设计
1.2.2 LAMP 反应的原理
1.2.3 LAMP 反应结果的判定
1.2.4 LAMP 检测方法的实践应用
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒
2.1.2 实验动物
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.1.5 主要溶液及培养基的配制
2.2 方法
2.2.1 LAMP 反应的初步建立
2.2.2 H9 亚型禽流感病毒的排毒规律
2.2.3 对排毒毒株的克隆测序分析
3 结果与分析
3.1 LAMP 反应的初步建立
3.1.1 LAMP 反应体系的初步建立
3.1.2 LAMP 引物的选取
3.1.3 LAMP 反应温度的确定
3.1.4 LAMP 反应的敏感性试验
3.1.5 LAMP 反应的特异性试验
3.2 排毒规律试验结果
3.2.1 各个毒株的血凝价
3.2.2 第一次攻毒试验
3.2.3 测定病毒的 EID50
3.2.4 攻毒试验
3.2.5 排毒情况
3.2.6 对排毒试验棉拭子样品的检测
3.3 对排毒毒株的克隆测序
3.3.1 RT-PCR 结果
3.3.2 病毒的克隆测序
3.3.3 序列分析
4 讨论
4.1 LAMP 反应的初步建立
4.2 H9 亚型禽流感病毒的排毒规律
结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽流感病毒跨种传播机制的研究进展[J]. 许晨. 科学. 2012(01)
[2]建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法[J]. 王秋泉,黄平,胡守旺,高秀洁,杨杏芬,李杰. 第三军医大学学报. 2010(03)
[3]环介导恒温扩增法（LAMP）检测金黄色葡萄球菌[J]. 李永刚,王德国,武建刚,霍贵成. 食品工业科技. 2010(01)
[4]猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 鑫婷,侯绍华,贾红,郭晓宇,丁家波,李延鹏,丁敏,朱鸿飞. 中国农业科学. 2010(01)
[5]高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立[J]. 黄平,胡守旺,王秋泉,杨杏芬,高秀洁,李杰. 第四军医大学学报. 2009(23)
[6]猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立[J]. 张兴娟,孙元,刘大飞,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2009(11)
[7]LAMP检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究[J]. 袁耀武,张亚爽,马晓燕,张伟. 中国食品学报. 2009(03)
[8]禽流感病毒分型基因芯片的研制[J]. 韩雪清,林祥梅,侯义宏,吴绍强,刘建,梅琳,贾广乐,杨泽晓. 微生物学报. 2008(09)
[9]H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较[J]. 白泉阳,孙颖杰,郑腾,张伯强,赵兴存,王武军,张志灯,张体银. 福建农业学报. 2008(02)
[10]口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 秦智锋,曾少灵,阮周曦,陈兵,曹琛福,花群义,吕建强,叶奕优,范万红,毕英佐. 中国预防兽医学报. 2008(05)
硕士论文
[1]环介导等温核酸扩增（LAMP）技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究[D]. 胡连霞.河北农业大学 2009
本文编号：3645947
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