苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路研究

发布时间：2022-05-03 01:12

　　疯草（locoweed）是豆科黄芪属（Astragalus）和棘豆属（Oxytropis）有毒植物的总称，在世界范围内广泛分布，动物采食后会导致严重的疯草病（locoism），极大地危害了草原畜牧业的发展。研究发现，疯草中的主要有毒成分是苦马豆素（1，2，8-trihyroxyindolizidine，swainsonine，SW）。妊娠山羊采食含有SW的植物后，引起胎盘发育迟缓、充血，胎盘滋养层细胞发生病变，并最终导致妊娠山羊流产。胎盘滋养层细胞在胚胎发育和胎盘形成过程中发挥着重要作用，一些病原和有毒物质引起的胎盘滋养层细胞凋亡是导致滋养层细胞病变和动物流产的主要原因。本研究以山羊胎盘滋养层细胞为研究模型，检测SW对山羊胎盘滋养层细胞的细胞周期和侵袭特性的影响，探索SW诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路，以期揭示SW损伤妊娠山羊胎盘并导致山羊流产的分子机制。研究取得以下结果。1.采集妊娠45～60d的萨能奶山羊胎盘组织，无菌条件下分离、纯化得到了原代山羊胎盘滋养层细胞。原代山羊胎盘滋养层细胞贴壁后呈不规则多边形，细胞长满单层后呈典型的铺路石状，具有接触抑制的生长特点。纯化得到的... 

【文章页数】：103 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
前言
文献综述
    第一章 胎盘滋养层细胞的研究进展
        1.1 滋养层细胞的功能
            1.1.1 滋养层细胞与妊娠识别
            1.1.2 滋养层细胞与胚胎附植
            1.1.3 滋养层细胞与胎盘形成
        1.2 胎盘滋养层细胞的体外培养
            1.2.1 胎盘滋养层细胞的分离
            1.2.2 胎盘滋养层细胞的纯化
        1.3 胎盘滋养层细胞的鉴定
        1.4 胎盘滋养层细胞的永生化
            1.4.1 端粒（Telomere）和端粒酶（Telomerase）的发现
            1.4.2 端粒和端粒酶的结构与功能
            1.4.3 端粒酶与细胞衰老、永生化
    第二章 胎盘滋养层细胞与细胞凋亡研究进展
        2.1 细胞凋亡的生物学特征
        2.2 细胞凋亡调控的分子基础
            2.2.1 Caspase 家族
            2.2.2 Bax/Bcl-2 蛋白家族
        2.3 细胞凋亡信号转导通路
            2.3.1 死亡受体通路
            2.3.2 线粒体通路
        2.4 胎盘滋养层细胞与细胞凋亡
            2.4.1 内源性调控因素
            2.4.2 外源性调控因素
            2.4.3 单核细胞/巨噬细胞
        2.5 苦马豆素与细胞凋亡
            2.5.1 苦马豆素和家畜中毒
            2.5.2 苦马豆素的诱导细胞凋亡作用
        2.6 本研究的目的和意义
试验研究
    第三章 永生化山羊胎盘滋养层细胞系的建立及生物学特性分析
        3.1 材料
            3.1.1 菌种和细胞
            3.1.2 组织和试验动物
            3.1.3 主要试剂
            3.1.4 试验所用溶液及其配制
            3.1.5 主要仪器
        3.2 方法
            3.2.1 山羊胎盘滋养层细胞的分离培养
            3.2.2 山羊胎盘滋养层细胞的鉴定
            3.2.3 hTERT 基因转染原代山羊胎盘滋养层细胞
            3.2.4 转染后山羊胎盘滋养层细胞的鉴定
            3.2.5 外源性 hTERT 基因在转染后山羊胎盘滋养层细胞中的表达
            3.2.6 山羊胎盘滋养层细胞生物学特性的分析
            3.2.7 统计学分析
        3.3 结果
            3.3.1 原代山羊胎盘滋养层细胞的分离
            3.3.2 pCI-neo-hTERT 质粒的鉴定
            3.3.3 G418 对山羊胎盘滋养层细胞最佳筛选浓度的确定
            3.3.4 转染后阳性细胞的扩大培养
            3.3.5 山羊胎盘滋养层细胞的形态特征
            3.3.6 山羊胎盘滋养层细胞的鉴定
            3.3.7 hTERT 基因在山羊胎盘滋养层细胞中的表达
            3.3.8 山羊胎盘滋养层细胞的生长特性
            3.3.9 山羊胎盘滋养层细胞激素分泌功能的检测
            3.3.10 体外培养的山羊胎盘滋养层细胞具有侵袭性
            3.3.11 软琼脂克隆形成试验
            3.3.12 裸鼠致瘤性试验
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 苦马豆素对山羊胎盘滋养层细胞迁移和侵袭功能的影响
        4.1 材料
            4.1.1 SW 与细胞
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 试验所用溶液及其配制
            4.1.4 主要仪器
        4.2 方法
            4.2.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响
            4.2.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞细胞周期的影响
            4.2.3 SW 对山羊胎盘滋养层细胞黏附能力的影响
            4.2.4 细胞迁移试验
            4.2.5 细胞侵袭试验
            4.2.6 Western blot 检测
            4.2.7 统计学分析
        4.3 结果
            4.3.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响
            4.3.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞细胞周期的影响
            4.3.3 SW 对山羊胎盘滋养层细胞周期蛋白的影响
            4.3.4 SW 对山羊胎盘滋养层细胞黏附能力的影响
            4.3.5 SW 对山羊胎盘滋养层细胞迁移能力的影响
            4.3.6 SW 对山羊胎盘滋养层细胞侵袭能力的影响
            4.3.7 SW 对山羊胎盘滋养层细胞 MT1-MMP、MMP-2 和 TIMP-2 的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路
        5.1 材料
            5.1.1 SW 与细胞
            5.1.2 主要试剂
            5.1.3 试验所用溶液及其配制
            5.1.4 主要仪器
        5.2 方法
            5.2.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响
            5.2.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞形态的影响
            5.2.3 DNA 片段化分析
            5.2.4 流式细胞术检测 SW 对山羊胎盘滋养层细胞凋亡率的影响
            5.2.5 蛋白浓度检测
            5.2.6 Caspase 活性检测
            5.2.7 Western blot 检测
            5.2.8 TUNEL 试验
            5.2.9 统计学分析
        5.3 结果
            5.3.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响
            5.3.2 SW 诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的形态学观察
            5.3.3 DNA 片段化分析
            5.3.4 SW 对山羊胎盘滋养层细胞凋亡率的影响
            5.3.5 Caspase 级联反应在 SW 诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡中的作用
            5.3.6 Caspase 抑制剂对 SW 诱导的山羊胎盘滋养层细胞凋亡的影响
            5.3.7 SW 对山羊胎盘滋养层细胞 Fas 和 FasL 表达的影响
            5.3.8 SW 促进山羊胎盘滋养层细胞中 Bax/Bcl-2 比值升高
            5.3.9 SW 促进山羊胎盘滋养层细胞线粒体中 Cytochrome c 的释放
            5.3.10 SW 选择性诱导妊娠山羊胎盘组织中滋养层细胞凋亡
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论与创新点
参考文献
缩略词和中英文对照表
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
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[3]滋养层细胞原代体外培养体系的建立[J]. 刘惠萍,王若光,李春梅,李宾玲,曾润清,秦明春,易鹏飞.  实用预防医学. 2006(05)
[4]人绒毛膜滋养层细胞的分离培养及DC-SIGN的表达研究[J]. 张琴,李俊男,陈黎,梁志清.  中华围产医学杂志. 2006(04)
[5]人绒毛膜滋养层细胞的分离纯化及鉴定[J]. 刘杰,章汉旺.  中国优生与遗传杂志. 2004(03)
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博士论文
[1]牦牛胚胎附植过程中细胞凋亡及其通路的研究[D]. 巨向红.甘肃农业大学 2006



本文编号：3650328