弓形虫致密颗粒和棒状体分泌蛋白的鉴定和功能研究

发布时间：2022-07-14 16:34

　　弓形虫是顶复门寄生虫中一种极具代表性的人兽共患病原。作为单细胞寄生虫,它可以感染几乎所有的温血动物和这些宿主所有的有核细胞。为了适应如此广泛的细胞类型和宿主范围,弓形虫依赖一大批分泌蛋白来介导虫体与宿主的互作,以满足虫体在不同寄生条件下的生长需求。致密颗粒蛋白（GRAs）和棒状体蛋白（ROPs）是其中两类重要的分泌蛋白,在虫体的生长发育和免疫逃避过程中发挥重要作用。截至目前,GRAs的家族成员研究不多,其组分有待挖掘;另一方面,大批ROPs已被发现,但其工作的分子机制并不十分清楚。因此,本研究采用蛋白质标记技术来发掘新的致密颗粒蛋白,用酵母双杂交技术筛选与弓形虫棒状体蛋白互作的宿主蛋白,具体的研究内容包括以下两个方面:（1）新型致密颗粒蛋白的筛选、鉴定和功能研究采用APEX和BirA*这两种基于邻近原则的蛋白标记技术,以已知的致密颗粒蛋白GRA1作为诱饵,我们对弓形虫潜在的GRA蛋白进行了生物素标记,并最终成功鉴定得到46个蛋白,其中包括20个已知的GRA蛋白和26个候选的GRAs。在这46个蛋白中,有17个是APEX和BirA*两种方法共同鉴定得到的,而这17个蛋白中有14个是已知的... 

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
缩略语表
第一章 前言
    1.1 弓形虫概述
        1.1.1 弓形虫和弓形虫病
        1.1.2 弓形虫的生活史
        1.1.3 弓形虫的宿主范围和流行病学
    1.2 弓形虫分泌蛋白的研究进展
        1.2.1 弓形虫的分泌蛋白类型
        1.2.2 弓形虫完成胞内生长周期需要分泌蛋白的协助
        1.2.3 弓形虫依赖分泌蛋白介导与宿主的互作
    1.3 蛋白标记技术研究进展
        1.3.1 生物素——亲和素系统
        1.3.2 生物素标记技术及其应用
        1.3.3 其它标记技术
    1.4 蛋白质相互作用技术的研究进展
        1.4.1 酵母双杂交技术
        1.4.2 免疫共沉淀技术
        1.4.3 Pull-down技术
        1.4.4 其它方法
    1.5 研究目的和意义
第二章 新型致密颗粒蛋白的筛选、鉴定和功能研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 虫株、菌株和细胞
        2.1.3 质粒
        2.1.4 引物
        2.1.5 主要仪器与试剂
        2.1.6 主要溶液及配制
        2.1.7 实验方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 生物素标记质粒的构建
        2.2.2 生物素标记虫株的构建
        2.2.3 融合蛋白GRA1-APEX/BirA*的表达检测
        2.2.4 生物素标记蛋白的检测
        2.2.5 标记蛋白的富集纯化
        2.2.6 蛋白质谱分析
        2.2.7 新型致密颗粒蛋白的鉴定
        2.2.8 候选蛋白的定位分析
        2.2.9 致密颗粒蛋白的功能研究
    2.3 讨论
        2.3.1 诱饵蛋白的选取、表达和比较
        2.3.2 质谱数据的处理
        2.3.3 候选致密颗粒蛋白的分析
        2.3.4 依赖APEX和 BirA*催化的生物素标记技术在弓形虫的应用
        2.3.5 APEX和 BirA*两方法的比较
    2.4 小结
第三章 与棒状体蛋白ROP16 互作宿主蛋白的筛选和鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 菌株和细胞
        3.1.2 质粒
        3.1.3 引物
        3.1.4 主要仪器与试剂
        3.1.5 实验方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 酵母双杂交诱饵质粒的构建
        3.2.2 诱饵质粒的自激活和毒性
        3.2.3 诱饵蛋白的表达检测
        3.2.4 互作宿主蛋白的筛选
        3.2.5 互作结构域的确定
        3.2.6 相互作用的验证
    3.3 讨论
        3.3.1 酵母双杂交系统的选择
        3.3.2 与ROP16 互作蛋白的筛选
    3.4 小结
第四章 结论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3661491