猪链球菌2型噬菌体裂解酶LyACCG的关键结构域及关键氨基酸位点鉴定

发布时间：2017-05-14 21:15

  本文关键词：猪链球菌2型噬菌体裂解酶LyACCG的关键结构域及关键氨基酸位点鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪链球菌2型(Streptococcus.suis 2,S.suis 2)是重要的人兽共患病原菌,临床分离株普遍耐药,传统的抗生素疗法面临挑战,基于噬菌体裂解酶的抗菌策略再现潜力。噬菌体裂解细菌依赖于侵染后期合成的裂解酶,可特异高效地水解细菌细胞壁。噬菌体SMP是迄今为止国内外分离到的唯一的一株S.suis 2烈性噬菌体,其编码的裂解酶LyACCG(又叫LySMP)由N-端一个amidase-5(A5)催化域、中间两个Cpl-7(C7)结合域及C-端一个glucosaminidase(G)催化域组成,为了鉴定LyACCG的关键结构域及催化域A5的关键氨基酸位点,本研究:(一)LyACCG的关键结构域鉴定。(1)原核表达LyACCG的各结构域片段。以噬菌体SMP基因组为模板,分别PCR扩增编码LyA、LyAC、LyACC、LyG、LyCG、LyCCG和LyACCG(依次对应于LyACCG的第1-145、1-195、1-240、300-410、195-410、150-410和1-481位氨基酸)的基因片段,重组于pSJ2质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG 27°C诱导表达,SDS-PAGE分析表明,各结构域片段均为胞内可溶性表达,其分子质量依次约为19 ku、25 ku、30 ku、16 ku、28 ku、32 ku和56 ku,符合预期大小。(2)定性分析各结构域片段的裂菌活性。大量培养收集各转化菌,超声破壁,离心取上清过滤,获蛋白粗提液,平板裂解试验检测显示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG(均含催化域A5)对S.suis 2强毒株HA9801的裂菌圈直径依次为1.2 cm、1.7 cm、2.2 cm和1.3 cm,而LyG、LyCG和LyCCG(均含催化域G,不含催化域A5)均无裂菌活性,说明LyACCG的裂菌活性来自于催化域A5,催化域G无裂菌活性;LyA、LyAC、LyACC和LyACCG均可杀灭猪链球菌2型(12株)和7型,对猪链球菌9型、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌(5株)、巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门菌均无裂解作用,LyA的裂菌谱和LyACCG相同,表明LyACCG作用的细菌种属特异性源自催化域A5,与结合域C7和催化域G无关。(3)定量比较LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌活性。镍离子亲和层析纯化LyA、LyAC、LyACC和LyACCG,以30 min内能够使108 cfu/mL的HA9801浊度下降一半的酶浓度为评价指标(酶活单位/Unit),结果显示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的浓度依次为8.17μmol/mL、3.29μmol/m L、0.28μmol/m L和1.85μmol/mL;LyACCG的浓度是LyACC的7倍,说明催化域G对酶活性具有抑制作用;LyA和LyAC的浓度分别是LyACC的29和12倍,说明结合域C7对催化域A5的活性有促进作用,但不是决定作用。2μmol/m L的LyACC和LyACCG分别可使生物被膜内的HA9801的细菌密度下降44.23%和14.44%,再证催化域G的存在抑制了酶活性。(4)LyACC裂菌活性的影响因素分析。LyACC的最适反应pH=8.0,Fe2+和Mg2+对其裂菌活性没有影响,Zn2+、Cu2+和高浓度的Ca2+会抑制其裂菌活性。(二)催化域A5的关键氨基酸位点鉴定。(1)催化域A5中各氨基酸位点的保守性分析。用NCBI、Uniport和Pfam数据库,比对分析并计算催化域A5中各氨基酸位点的保守性,选择11个高度保守的氨基酸位点(Y18、D30、C31、S32、G43、T53、G85、G92、G95、H96和I107)和3个保守性较低的氨基酸位点(E70、D73或D75)待突变。(2)高保守性氨基酸位点的突变。以质粒pSJ2-lyacc为模板,将11个保守氨基酸位点的密码子分别定点突变为丙氨酸(A),突变质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG 27°C诱导表达的各突变依次命名为Y18A、D30A、C31A、S32A、G43A、T53A、G85A、G92A、G95A、H96A和I107A,SDS-PAGE分析表明,各突变体均为胞内可溶性表达,分子质量均约为30 ku,符合预期大小。(3)低保守性氨基酸位点的突变。以质粒pSJ2-lyacc为模板,将3个低保守的氨基酸位点同时定点突变为精氨酸,构建质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG 27°C诱导表达的突变体命名为Ly7X,SDSPAGE分析表明,突变体Ly7X为胞内可溶性表达,其分子质量约为30 ku,符合预期大小。(4)各突变体的裂菌活性分析。各突变体的蛋白粗提液经平板裂解试验检测显示,突变体D30A、C31A、S32A、G43A、T53A和H96A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性,说明D30、C31、S32、G43、T53和H96是LyACC的关键氨基酸位点;突变体Y18A、G85A、G92A、G95A和I107A的裂菌圈直径较LyACC依次减小了0.9 cm、0.8 cm、0.3 cm、0.5 cm和0.3cm,说明Y18、G85、G92、G95和I107对LyACC的裂菌活性有重要作用;突变体Ly7X的裂菌圈直径较LyACC减小了0.8 cm,说明保守性较低的E70、D73和D75对LyACC的裂菌活性也有重要作用。
【关键词】：猪链球菌 噬菌体 裂解酶 分段表达 裂菌活性 关键氨基酸位点
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.611
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 缩略语表8-11
• 第一篇 文献综述11-23
• 1 猪链球菌11-14
• 1.1 概述11
• 1.2 流行病学11-12
• 1.3 猪链球菌的致病机制12-13
• 1.4 猪链球菌耐药性的研究13-14
• 2 噬菌体14-18
• 2.1 噬菌体概述14-15
• 2.2 噬菌体疗法15-16
• 2.3 猪链球菌噬菌体16-18
• 3 裂解酶18-22
• 3.1 裂解酶概述18-19
• 3.2 裂解酶的结构组成19-20
• 3.3 细菌对裂解酶的耐药性20-21
• 3.4 裂解酶的应用21-22
• 4 展望22-23
• 第二篇 试验部分23-56
• 第一章 LyACCG的结构域片段表达23-33
• 1 材料方法23-29
• 1.1 试验菌株和主要试剂23-24
• 1.2 LyACCG结构域的预测24
• 1.3 PCR扩增24-25
• 1.4 原核表达载体的构建25-26
• 1.5 重组质粒转化E.coli DH5α 感受态细胞26-27
• 1.6 重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞27
• 1.7 各结构域片段的原核表达27-28
• 1.8 SDS-PAGE分析原核表达的各结构域片段28-29
• 2 结果29-31
• 2.1 LyACCG的结构域组成29
• 2.2 PCR扩增结果29-30
• 2.3 PCR鉴定及测序分析30
• 2.4 各结构域片段的原核表达30-31
• 3 结论31-33
• 第二章 裂解酶LyACCG的关键结构域鉴定33-48
• 1 材料方法33-38
• 1.1 试验菌株和主要试剂33-34
• 1.2 各结构域片段的裂菌活性检测34
• 1.3 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG裂菌谱的测定34
• 1.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的镍柱纯化34-35
• 1.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的浓度测定35
• 1.6 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活单位测定35-36
• 1.7 LyACC和LyACCG生物被膜清除能力测定36
• 1.8 LyACC的离子纯化36
• 1.9 LyACC的酶活单位测定36-37
• 1.10 LyACC最适反应pH的测定37
• 1.11 还原剂对LyACC裂菌活性的影响37
• 1.12 金属离子对LyACC裂菌活性的影响37-38
• 2 结果38-45
• 2.1 各结构域片段的裂菌活性38
• 2.2 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌谱38-40
• 2.3 镍柱纯化的LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的SDS-PAGE分析40
• 2.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的浓度40
• 2.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活单位40-41
• 2.6 LyACC和LyACCG清除HA9801生物被膜的效率41-42
• 2.7 SDS-PAGE分析离子纯化的LyACC42
• 2.8 LyACC的酶活单位42
• 2.9 LyACC的最适反应pH42-43
• 2.10 还原剂对LyACC裂菌活性的影响43
• 2.11 金属离子对LyACC裂菌活性的影响43-45
• 3 讨论45-48
• 第三章 催化域A5的关键氨基酸位点鉴定48-56
• 1 材料与方法48-51
• 1.1 试验菌株和主要试剂48
• 1.2 催化域A5中各氨基酸位点的保守性分析48
• 1.3 催化域A5中保守氨基酸位点的选择与突变48-50
• 1.4 催化域A5中保守性较低的酸性氨基酸位点的筛选与突变50-51
• 1.5 LyACC及其突变体的原核表达51
• 1.6 LyACC及其突变体的裂菌活性检测51
• 2 结果51-54
• 2.1 催化域A5中保守氨基酸位点的选择及突变结果51-52
• 2.2 催化域A5中保守性较低的酸性氨基酸位点的选择及突变结果52-53
• 2.3 LyACC及其突变体的裂菌活性53-54
• 3 讨论54-56
• 结论56-57
• 参考文献57-65
• 附录 试剂配制65-67
• 致谢67-68
• 导师简介68-70
• 作者简介70-71

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