角化细胞源外泌体携带miR-330-5p通过靶向TYR抑制黑色素细胞色素生成
发布时间:2022-07-20 19:43
色素沉着需要复杂的机制来调控。多项研究表明microRNAs(miRNAs)可以参与调控色素沉着,但是机制尚未阐明。外泌体作为细胞间的通讯载体,能够与相邻或远处的细胞进行交流。本研究证实了外泌体携带miRNAs参与角化细胞和黑色素细胞串扰的一种新型调节色素沉着的机制。且运用多种分子生物学技术研究分析了 miR-330-5p对色素沉着的抑制作用,外泌体特异性标志物TSG101在角化细胞和黑色素细胞中的表达与定位,将黑色素细胞与过量表达miR-330-5p的外泌体共培养,检测共培养后黑色素细胞产生黑色素含量的变化,以及靶基因TYR及其相关基因TYRP1、TYRP2和MITF表达量的变化。结果如下:(1)利用qRT-PCR技术和western blotting技术分析黑色素细胞过表达miR-330-5p后,TYR、TYRP1和TYRP2的相对表达量。二项结果均表明miR-330-5p可有效抑制TYR及其相关基因的表达,同时检测黑色素含量,结果显示过表达组黑色素含量降低。(2)利用免疫荧光、qRT-PCR技术和western blotting技术鉴定角化细胞分泌的外泌体。免疫荧光结果显示:TS...
【文章页数】:56 页
【学位级别】:硕士
【文章目录】:
摘要
前言
文献综述
1. 黑色素生成研究
1.1 黑色素生物学特性
1.2 紫外线辐射与黑色素生成
1.3 黑色素生成相关基因
2. miRNAs及其与皮肤相关的研究
3. 外泌体相关研究
3.1 外泌体的生物学特性
3.2 外泌体的功能
3.3 外泌体在皮肤生理和病理过程的应用
实验一 外源性miR-330-5p下调黑色素细胞中TYR表达
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与仪器
2 实验方法
2.1 小鼠黑色素细胞的培养
2.2 miR-330-5p转染小鼠黑色素细胞
2.3 黑色素含量的测定
2.4 细胞总RNA和总蛋白的提取
2.5 qRT-PCR检测TYR及其下游基因
2.6 Western Blotting分析TYR及其下游基因
2.7 数据处理
3 结果
3.1 miR-330-5p转染小鼠黑色素细胞及效率
3.2 转染后细胞内黑色素含量
3.3 转染后细胞内TYR及其下游基因mRNA表达水平
3.4 转染后细胞内TYR及其下游蛋白表达水平
4 小结
实验二 角化细胞源外泌体的分离与鉴定
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与仪器
2 实验方法
2.1 小鼠角化细胞的培养
2.2 免疫荧光法分析角化细胞中外泌体特异性蛋白的表达
2.3 角化细胞转染mR-330-5p
2.4 获得富含外泌体的培养基
2.5 超速离心法分离提取外泌体
2.6 外泌体总蛋白的提取
2.7 Western Blotting分析外泌体特异性蛋白
2.8 外泌体总RNA的提取
2.9 qRT-PCR检测外泌体中miR-330-5p
3 结果
3.1 小鼠角化细胞形态
3.2 TSG101在角化细胞上的表达
3.3 TSG101和CD9在外泌体蛋白中的表达
3.4 转染后角化细胞分泌的外泌体miR-330-5p表达水平
4 小结
实验三 角化细胞源性外泌体携带miR-330-5p与黑色素细胞的相互作用
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与材料
2 实验方法
2.1 外泌体与黑色素细胞共培养
2.2 荧光原位双杂交
2.3 miR-330-5p转染小鼠角化细胞
2.4 黑色素细胞免疫荧光
2.5 黑色素含量测定
2.6 黑色素细胞总RNA和总蛋白的提取
2.8 qRT-PCR检测TYR及其上下游基因
2.9 Western Blotting分析TYR及其上下游基因
3 结果
3.1 黑色素细胞荧光原位杂交结果
3.2 外源性外泌体在黑色素细胞中的表达
3.3 共培养后细胞内黑色素含量
3.4 共培养后细胞内TYR及其上下游基因mRNA表达水平
3.5 共培养后细胞内TYR及其上下游蛋白表达水平
4 小结
讨论
参考文献
Abstract
附录
在读研究生期间发表论文
中英文对照及缩略表
致谢
【参考文献】:
期刊论文
[1]miR-411a-3p抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成[J]. 李佳晟,孙晓江,胡帅鹏,姬凯元,刘博,刘学贤,杨姗姗,张俊珍,范瑞文. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(09)
[2]内皮素3在不同毛色绵羊皮肤中的差异表达[J]. 杨姗姗,白俊明,范瑞文,耿建军,焦丁兴,周英,董常生. 畜牧兽医学报. 2015(11)
本文编号:3664643
【文章页数】:56 页
【学位级别】:硕士
【文章目录】:
摘要
前言
文献综述
1. 黑色素生成研究
1.1 黑色素生物学特性
1.2 紫外线辐射与黑色素生成
1.3 黑色素生成相关基因
2. miRNAs及其与皮肤相关的研究
3. 外泌体相关研究
3.1 外泌体的生物学特性
3.2 外泌体的功能
3.3 外泌体在皮肤生理和病理过程的应用
实验一 外源性miR-330-5p下调黑色素细胞中TYR表达
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与仪器
2 实验方法
2.1 小鼠黑色素细胞的培养
2.2 miR-330-5p转染小鼠黑色素细胞
2.3 黑色素含量的测定
2.4 细胞总RNA和总蛋白的提取
2.5 qRT-PCR检测TYR及其下游基因
2.6 Western Blotting分析TYR及其下游基因
2.7 数据处理
3 结果
3.1 miR-330-5p转染小鼠黑色素细胞及效率
3.2 转染后细胞内黑色素含量
3.3 转染后细胞内TYR及其下游基因mRNA表达水平
3.4 转染后细胞内TYR及其下游蛋白表达水平
4 小结
实验二 角化细胞源外泌体的分离与鉴定
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与仪器
2 实验方法
2.1 小鼠角化细胞的培养
2.2 免疫荧光法分析角化细胞中外泌体特异性蛋白的表达
2.3 角化细胞转染mR-330-5p
2.4 获得富含外泌体的培养基
2.5 超速离心法分离提取外泌体
2.6 外泌体总蛋白的提取
2.7 Western Blotting分析外泌体特异性蛋白
2.8 外泌体总RNA的提取
2.9 qRT-PCR检测外泌体中miR-330-5p
3 结果
3.1 小鼠角化细胞形态
3.2 TSG101在角化细胞上的表达
3.3 TSG101和CD9在外泌体蛋白中的表达
3.4 转染后角化细胞分泌的外泌体miR-330-5p表达水平
4 小结
实验三 角化细胞源性外泌体携带miR-330-5p与黑色素细胞的相互作用
1 实验材料与主要试剂仪器
1.1 实验材料
1.2 实验试剂与材料
2 实验方法
2.1 外泌体与黑色素细胞共培养
2.2 荧光原位双杂交
2.3 miR-330-5p转染小鼠角化细胞
2.4 黑色素细胞免疫荧光
2.5 黑色素含量测定
2.6 黑色素细胞总RNA和总蛋白的提取
2.8 qRT-PCR检测TYR及其上下游基因
2.9 Western Blotting分析TYR及其上下游基因
3 结果
3.1 黑色素细胞荧光原位杂交结果
3.2 外源性外泌体在黑色素细胞中的表达
3.3 共培养后细胞内黑色素含量
3.4 共培养后细胞内TYR及其上下游基因mRNA表达水平
3.5 共培养后细胞内TYR及其上下游蛋白表达水平
4 小结
讨论
参考文献
Abstract
附录
在读研究生期间发表论文
中英文对照及缩略表
致谢
【参考文献】:
期刊论文
[1]miR-411a-3p抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成[J]. 李佳晟,孙晓江,胡帅鹏,姬凯元,刘博,刘学贤,杨姗姗,张俊珍,范瑞文. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(09)
[2]内皮素3在不同毛色绵羊皮肤中的差异表达[J]. 杨姗姗,白俊明,范瑞文,耿建军,焦丁兴,周英,董常生. 畜牧兽医学报. 2015(11)
本文编号:3664643
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