大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究

发布时间：2022-07-22 14:29

　　犊牛大肠杆菌性腹泻是牛场常发且危害严重的一种细菌性传染病，主要表现为肠炎或败血症，是新生犊牛死亡的主要病因之一，给养牛业带来巨大的经济损失。目前尚无有效预防该病的商品化疫苗，因此，研制有效的针对该病的疫苗对预防该病的发生具有重要意义。引起犊牛腹泻的大肠杆菌主要毒力因子有肠毒素（包括LT、ST）、志贺毒素和粘附素。LT和LTB具有很强的免疫原性并且具有免疫佐剂的功效，是近些年来疫苗研究的热点。志贺毒素引起的犊牛腹泻的死亡率最高，它有两个型，1型和2型，2型志贺毒素的毒性强于1型，是产志贺毒素大肠杆菌的重要毒力因子，其B亚基无毒且具有免疫原性。ST单独不具有免疫原性，而粘附素的抗原类型又过多，因此，将大肠杆菌不耐热肠毒素和志贺毒素作为疫苗抗原是研制犊牛大肠杆菌疫苗的主要策略。本研究旨在探索ltb和stx2b融合编码基因的构建，在原核系统中表达，以及表达蛋白诱导小鼠体液免疫的情况，为犊牛大肠杆菌疫苗的研究奠定技术基础和提供实验依据。本研究将PCR扩增出的ltb和stx2b基因用一段柔性linker序列连接后插入pMD18T simple载体中，经序列分析鉴定后，再通过酶切，连接，转化宿主菌R... 

【文章页数】：162 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 犊牛腹泻概述
        1.1.1 病毒性腹泻
        1.1.2 细菌性腹泻
        1.1.3 寄生虫性腹泻
    1.2 犊牛大肠杆菌性腹泻
        1.2.1 病原学
        1.2.2 流行特点
        1.2.3 临床症状及病理变化
        1.2.4 防治
    1.3 大肠杆菌毒力因子
        1.3.1 粘附素
        1.3.2 肠毒素
        1.3.3 志贺毒素
    1.4 大肠杆菌疫苗的研究进展
        1.4.1 灭活苗
        1.4.2 亚单位疫苗
        1.4.3 核酸疫苗
        1.4.4 活载体疫苗
    1.5 研究目的与意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株、质粒、实验动物及细胞系
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 ltb 与 stx2b 融合基因的构建
        2.2.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达与鉴定
        2.2.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定
        2.2.4 重组蛋白纯化
        2.2.5 实验动物分组及免疫
        2.2.6 免疫抗体检测
        2.2.7 体内中和试验
        2.2.8 体外中和试验
3 结果与分析
    3.1 ltb-stx2b 融合基因的构建
        3.1.1 ltb 基因的扩增
        3.1.2 stx2b 基因的扩增
        3.1.3 ltb-stx2b 基因扩增
        3.1.4 ltb-stx2b 重组基因序列的测定
    3.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达
        3.2.1 重组 E.coli Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B 的表达
        3.2.2 重组 E.coli Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B 的表达
    3.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定
        3.3.1 stx2b 基因的扩增
        3.3.2 stx2b 重组基因序列的测定
        3.3.3 重组表达质粒 pCold I-Stx2B 的鉴定
        3.3.4 重组 E.coli Rosetta/pCold-I-Stx2B 的表达与鉴定
    3.4 免疫原的制备
    3.5 免疫抗体的检测
    3.6 体内中和试验
        3.6.1 LT 和 Stx2 对小鼠的 LD50 的测定
        3.6.2 LT 的小鼠体内中和试验
        3.6.3 Stx2 的体内中和试验
    3.7 体外中和试验
        3.7.1 Stx2 对 Vero 细胞的毒性作用
        3.7.2 Stx2 对 Vero 细胞 CD50 测定
        3.7.3 Stx2 的中和效价
4 讨论
    4.1 融合 PCR 技术
    4.2 不同免疫原的免疫效力评价
    4.3 初乳对新生犊牛的重要性
    4.4 亚单位疫苗在牛病上的应用研究
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3664780