JEV PrM/M蛋白单克隆抗体的制备及JEV P3感染U251细胞蛋白质组学分析
发布时间：2022-07-22 18:07
日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种严重影响中枢神经系统功能的虫媒性人兽共患传染病。Pr M蛋白是JEV的结构蛋白之一,主要存在于感染细胞内未成熟的病毒颗粒中。M蛋白由Pr M蛋白切割而来,参与病毒囊膜的构成,与E蛋白的C端相互作用,在细胞内对E蛋白进行折叠、修饰和装配,可诱生轻度中和抗体,与病毒核心组成具有感染性的病毒。同时JEV靶向神经元,可激活中枢神经系统中的星形胶质细胞和小胶质细胞信号,诱发大量细胞因子和促炎症因子的分泌,引起大脑炎症风暴。但是,Pr M在病毒复制、感染以及诱导中和抗体活性中的功能还不清楚,同时在细胞内如何对E蛋白进行折叠、修饰和装配也不清楚。另外JEV在引起大脑炎症风暴的过程中,还有哪些潜在的蛋白会产生作用,也没有得到完整的解答。本研究制备了Pr M/M的单克隆抗体,并通过间接ELISA、IFA、Western Blot等方法验证单抗的生物学特性。同时,利用i TRAQ技术对JEV P3感染U251细胞的蛋白质组进行了分析。具体研究内容如...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略语表（Abbreviation）
第一章JEV文献综述
1. 乙型脑炎的流行病学
1.1 乙脑的流行特征
1.2 乙脑的传播媒介与易感群体
2. 乙型脑炎病毒的生物学特性
2.1 乙型脑炎病毒的病原性
2.2 乙型脑炎病毒的生物学特性
2.3 乙型脑炎病毒的结构蛋白
2.4 乙型脑炎病毒的非结构蛋白
2.5 乙型脑炎病毒的理化特性
2.6 乙型脑炎病毒的增殖特性
2.7 乙型脑炎病毒的复制过程
3. 乙型脑炎病毒的入侵和致病机理
4. 乙型脑炎的临床表现
5. 乙型脑炎的病理变化
6. 乙型脑炎的诊断
6.1 血清学检测
6.2 病毒分离培养
6.3 分子生物学检测
7. 乙型脑炎的防治及疫苗研究现状
7.1 灭活疫苗
7.2 减毒活疫苗
第二章JEV M蛋白单克隆抗体的制备及特性分析
1.前言
1.1 单克隆抗体的原理
1.2 单克隆抗体的应用及发展
2.研究目的与意义
3. 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株、病毒、细胞和动物
3.1.2 主要试剂、仪器和耗材
3.1.3 抗生素及其配制方法
3.1.4 主要培养基及其配制
3.1.5 主要缓冲液（溶液）及其配制
3.2 实验方法与步骤
3.2.1 M蛋白引物的设计
3.2.2 M蛋白基因的扩增
3.2.3 M蛋白基因片段的纯化回收
3.2.4 PCR回收产物及表达载体的处理
3.2.5 目的基因与载体的连接
3.2.6 连接产物的转化
3.2.7 重组质粒的提取
3.2.8 重组质粒的鉴定
3.2.9 重组质粒p28a-sumo-M的诱导表达
3.2.10 表达产物p28a-sumo-M的SDS-PAGE分析
3.2.11 表达产物p28a-sumo-M的Western Blot分析
3.2.12 不溶性包涵体蛋白纯化方法
3.2.13 动物免疫
3.2.14 间接ELISA检测方法的建立
3.2.15 间接ELISA法检测小鼠的免疫效价
3.2.16 SP2/0 骨髓瘤细胞的制备
3.2.17 免疫脾细胞的制备
3.2.18 饲养细胞的制备
3.2.19 细胞融合
3.2.20 阳性杂交瘤细胞的筛选
3.2.21 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
3.2.22 杂交瘤细胞的染色体计数
3.2.23 单抗腹水的制备及抗体效价的测定
3.2.24 单克隆抗体的纯化
3.2.25 单克隆抗体蛋白质含量的测定
3.2.26 单克隆抗体的亚型鉴定
3.2.27 单克隆抗体的IFA分析
3.2.28 单克隆抗体的Western Blot分析
3.2.29 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
3.2.30 小片段的原核表达
3.2.31 单克隆抗体靶抗原表位的粗步判定
4.结果与分析
4.1 结果
4.1.1 M基因片段PCR扩增及克隆质粒的鉴定
4.1.2 p28a-sumo-M重组蛋白的表达及纯化
4.1.3 M蛋白最佳抗原包被浓度的测定
4.1.4 小鼠免疫效价的检测
4.1.5 杂交瘤细胞的筛选
4.1.6 杂交瘤细胞遗传性的稳定分析
4.1.7 单克隆抗体效价的检测
4.1.8 单克隆抗体亚型的检测
4.1.9 单克隆抗体的IFA分析
4.1.10 单克隆抗体的Western Blot分析
4.1.11 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
4.1.12 小片段的原核表达分析
4.1.13 M蛋白抗原表位的区域分析
5. 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 单抗的应用前景
5.1.2 蛋白表达
5.1.3 动物免疫
5.1.4 细胞融合
5.1.5 单克隆抗体的筛选
5.1.6 M蛋白靶抗原的鉴定
5.2 小结
第三章 基于iTRAQ技术研究JEV P3 株感染U251 细胞的蛋白表达差异
1. 前言
2. 研究目的与意义
3. 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 U251 细胞的复苏
3.2.2 病毒感染
3.2.3 iTRAQ技术分析细胞样品
3.2.4 荧光定量引物的设计
3.2.5 病毒总RNA的提取
3.2.6 RT-PCR
3.2.7 转录水平蛋白表达差异分析
3.2.8 基因表达数据分析
4. 实验结果与分析
4.1 实验结果
4.1.1 蛋白质的鉴定
4.1.2 GO分析
4.1.3 差异蛋白定量信息的统计
4.1.4 荧光定量分析差异蛋白质的mRNA水平
5. 讨论与结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质组学及其在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景[J]. 董书伟,李巍,严作廷,王旭荣,高昭辉,荔霞. 动物医学进展. 2012(12)
[2]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君. 中国畜牧兽医. 2012(01)
[3]单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J]. 孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝. 免疫学杂志. 2011(02)
[4]流行性乙型脑炎病毒分子生物学研究进展[J]. 黄丽娟,张海林. 中国预防医学杂志. 2009(08)
[5]人源化单克隆抗体研究进展[J]. 吴永强,董关木. 微生物学免疫学进展. 2008(02)
[6]单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J]. 胡春艳,刘全忠. 安徽预防医学杂志. 2008(02)
[7]猪乙型脑炎研究进展[J]. 邓永,徐高原. 养殖与饲料. 2007(06)
[8]辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定[J]. 王俊文,付士红,王环宇,毛晓燕,刘卫滨,何英,孙肖红,蔡增林,吴立平,赵习芳,韩瑞红,景雅,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2006(01)
[9]乙型脑炎血清学诊断方法研究进展[J]. 宋大伟,何生虎. 农业科学研究. 2006(01)
[10]黑龙江省部分地区虫媒病毒调查[J]. 王环宇,付士红,王俊文,何英,蔡增林,韩瑞红,刘国平,孙肖红,张强,唐青,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2005(04)
博士论文
[1]乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D]. 李么明.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]日本乙型脑炎病毒prM-E蛋白N-糖基化的功能研究[D]. 宰俊杰.华中农业大学 2011
[2]流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表达及ELISA诊断试剂盒的研制[D]. 杨耀武.沈阳农业大学 2003
本文编号：3665086
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略语表（Abbreviation）
第一章JEV文献综述
1. 乙型脑炎的流行病学
1.1 乙脑的流行特征
1.2 乙脑的传播媒介与易感群体
2. 乙型脑炎病毒的生物学特性
2.1 乙型脑炎病毒的病原性
2.2 乙型脑炎病毒的生物学特性
2.3 乙型脑炎病毒的结构蛋白
2.4 乙型脑炎病毒的非结构蛋白
2.5 乙型脑炎病毒的理化特性
2.6 乙型脑炎病毒的增殖特性
2.7 乙型脑炎病毒的复制过程
3. 乙型脑炎病毒的入侵和致病机理
4. 乙型脑炎的临床表现
5. 乙型脑炎的病理变化
6. 乙型脑炎的诊断
6.1 血清学检测
6.2 病毒分离培养
6.3 分子生物学检测
7. 乙型脑炎的防治及疫苗研究现状
7.1 灭活疫苗
7.2 减毒活疫苗
第二章JEV M蛋白单克隆抗体的制备及特性分析
1.前言
1.1 单克隆抗体的原理
1.2 单克隆抗体的应用及发展
2.研究目的与意义
3. 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株、病毒、细胞和动物
3.1.2 主要试剂、仪器和耗材
3.1.3 抗生素及其配制方法
3.1.4 主要培养基及其配制
3.1.5 主要缓冲液（溶液）及其配制
3.2 实验方法与步骤
3.2.1 M蛋白引物的设计
3.2.2 M蛋白基因的扩增
3.2.3 M蛋白基因片段的纯化回收
3.2.4 PCR回收产物及表达载体的处理
3.2.5 目的基因与载体的连接
3.2.6 连接产物的转化
3.2.7 重组质粒的提取
3.2.8 重组质粒的鉴定
3.2.9 重组质粒p28a-sumo-M的诱导表达
3.2.10 表达产物p28a-sumo-M的SDS-PAGE分析
3.2.11 表达产物p28a-sumo-M的Western Blot分析
3.2.12 不溶性包涵体蛋白纯化方法
3.2.13 动物免疫
3.2.14 间接ELISA检测方法的建立
3.2.15 间接ELISA法检测小鼠的免疫效价
3.2.16 SP2/0 骨髓瘤细胞的制备
3.2.17 免疫脾细胞的制备
3.2.18 饲养细胞的制备
3.2.19 细胞融合
3.2.20 阳性杂交瘤细胞的筛选
3.2.21 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
3.2.22 杂交瘤细胞的染色体计数
3.2.23 单抗腹水的制备及抗体效价的测定
3.2.24 单克隆抗体的纯化
3.2.25 单克隆抗体蛋白质含量的测定
3.2.26 单克隆抗体的亚型鉴定
3.2.27 单克隆抗体的IFA分析
3.2.28 单克隆抗体的Western Blot分析
3.2.29 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
3.2.30 小片段的原核表达
3.2.31 单克隆抗体靶抗原表位的粗步判定
4.结果与分析
4.1 结果
4.1.1 M基因片段PCR扩增及克隆质粒的鉴定
4.1.2 p28a-sumo-M重组蛋白的表达及纯化
4.1.3 M蛋白最佳抗原包被浓度的测定
4.1.4 小鼠免疫效价的检测
4.1.5 杂交瘤细胞的筛选
4.1.6 杂交瘤细胞遗传性的稳定分析
4.1.7 单克隆抗体效价的检测
4.1.8 单克隆抗体亚型的检测
4.1.9 单克隆抗体的IFA分析
4.1.10 单克隆抗体的Western Blot分析
4.1.11 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
4.1.12 小片段的原核表达分析
4.1.13 M蛋白抗原表位的区域分析
5. 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 单抗的应用前景
5.1.2 蛋白表达
5.1.3 动物免疫
5.1.4 细胞融合
5.1.5 单克隆抗体的筛选
5.1.6 M蛋白靶抗原的鉴定
5.2 小结
第三章 基于iTRAQ技术研究JEV P3 株感染U251 细胞的蛋白表达差异
1. 前言
2. 研究目的与意义
3. 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 U251 细胞的复苏
3.2.2 病毒感染
3.2.3 iTRAQ技术分析细胞样品
3.2.4 荧光定量引物的设计
3.2.5 病毒总RNA的提取
3.2.6 RT-PCR
3.2.7 转录水平蛋白表达差异分析
3.2.8 基因表达数据分析
4. 实验结果与分析
4.1 实验结果
4.1.1 蛋白质的鉴定
4.1.2 GO分析
4.1.3 差异蛋白定量信息的统计
4.1.4 荧光定量分析差异蛋白质的mRNA水平
5. 讨论与结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质组学及其在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景[J]. 董书伟,李巍,严作廷,王旭荣,高昭辉,荔霞. 动物医学进展. 2012(12)
[2]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君. 中国畜牧兽医. 2012(01)
[3]单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J]. 孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝. 免疫学杂志. 2011(02)
[4]流行性乙型脑炎病毒分子生物学研究进展[J]. 黄丽娟,张海林. 中国预防医学杂志. 2009(08)
[5]人源化单克隆抗体研究进展[J]. 吴永强,董关木. 微生物学免疫学进展. 2008(02)
[6]单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J]. 胡春艳,刘全忠. 安徽预防医学杂志. 2008(02)
[7]猪乙型脑炎研究进展[J]. 邓永,徐高原. 养殖与饲料. 2007(06)
[8]辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定[J]. 王俊文,付士红,王环宇,毛晓燕,刘卫滨,何英,孙肖红,蔡增林,吴立平,赵习芳,韩瑞红,景雅,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2006(01)
[9]乙型脑炎血清学诊断方法研究进展[J]. 宋大伟,何生虎. 农业科学研究. 2006(01)
[10]黑龙江省部分地区虫媒病毒调查[J]. 王环宇,付士红,王俊文,何英,蔡增林,韩瑞红,刘国平,孙肖红,张强,唐青,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2005(04)
博士论文
[1]乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D]. 李么明.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]日本乙型脑炎病毒prM-E蛋白N-糖基化的功能研究[D]. 宰俊杰.华中农业大学 2011
[2]流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表达及ELISA诊断试剂盒的研制[D]. 杨耀武.沈阳农业大学 2003
本文编号：3665086
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