单核细胞增生性李斯特菌lmo1521基因的鉴定

发布时间：2022-08-04 11:53

　　单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenesis,LM）是一种在环境中普遍存在的革兰氏阳性菌,能引起人和动物严重的食源性感染,致病率高达30%-40%。自溶素是在细菌中普遍存在的肽聚糖水解酶,与细菌的多种生物学功能有关,参与细菌的致病过程。目前,已经从单核细胞增生性李斯特菌中鉴定出8种自溶素蛋白。单核细胞增生性李斯特菌标准菌株EGD-e（1/2a血清型）全基因组序列分析及转录组测序等技术研究表明lmo1521基因含假定酰胺酶结构域及GW模块,在侵染小鼠时该基因表达量上调,预测其可能是自溶素基因。本研究用实验证据鉴定该基因是自溶素基因。本实验以单核细胞增生性李斯特菌lmo1521基因CDS区域为目标基因序列,构建pET-22b-lmo1521重组质粒,转化至蛋白表达宿主菌E.coliBL21（DE3）,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）为诱导剂,原核表达得到可溶性Lmo1521重组蛋白,用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,从而得到高纯度、高浓度目标蛋白Lmo1 521。综合采用多种方法研究Lmo1521蛋白是否具有细胞壁水解酶活性。首先以提纯的单增李斯特菌细胞壁为底物,... 

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
    1.1 前言
    1.2 单增李斯特菌中的自溶素
    1.3 自溶素的结构
        1.3.1 信号肽序列
        1.3.2 肽聚糖水解酶域
        1.3.3 细胞壁锚定域
    1.4 自溶素在细菌致病过程中的作用
        1.4.1 参与细胞粘附与侵袭
        1.4.2 参与细菌生存与繁殖
        1.4.3 诱导炎症反应
        1.4.4 参与细菌毒力
    1.5 自溶素的调控机制
        1.5.1 转录水平调控
        1.5.2 自我抑制
        1.5.3 肽聚糖结构修饰
        1.5.4 pH调控
    1.6 选题依据及研究内容
    1.7 研究目的及意义
2 单核细胞增生性李斯特菌lmo1521基因的表达及产物纯化
    2.1 实验材料、主要试剂、试剂配制和仪器设备
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 试剂配制
        2.1.4 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 lmo1521基因的原核表达
        2.2.2 SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白
        2.2.3 表达蛋白的可溶性分析
        2.2.4 Ni-NTA树脂纯化表达蛋白
        2.2.5 Ni-NTA树脂的再生
    2.3 结果与分析
        2.3.1 lmo1521基因表达产物Lmo1521蛋白
        2.3.2 Lmo1521蛋白为可溶性蛋白
        2.3.3 Ni-NTA亲和纯化获得高纯度Lmo1521蛋白
3 Lmo1521蛋白细胞壁水解酶活性分析
    3.1 实验材料、主要试剂、试剂配制和仪器设备
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 试剂配制
        3.1.4 仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 单核细胞增生性李斯特菌和大肠杆菌细胞壁的制备
        3.2.2 复性SDS-PAGE电泳分析Lmo1521细胞壁水解酶活性
        3.2.3 革兰氏染色观察Lmo1521蛋白对单增李斯特菌活细胞的破坏作用
        3.2.4 过表达的Lmo1521蛋白对宿主菌生长的影响
        3.2.5 Lmo1521蛋白对不同底物降解活性的研究
        3.2.6 Lmo1521蛋白最适水解pH值的研究
    3.3 结果与分析
        3.3.1 复性SDS-PAGE电泳证明Lmo1521蛋白具有水解自身细胞壁的活性
        3.3.2 Lmo1521蛋白能够破坏单增李斯特菌活细胞
        3.3.3 过表达的Lmo1521蛋白抑制宿主菌的生长
        3.3.4 Lmo1521蛋白水解不同的细胞壁底物
        3.3.5 Lmo1521蛋白最适水解pH值为中碱性
    3.4 讨论
4 构建pMAD△lmo1521重组质粒
    4.1 实验材料、主要试剂和仪器设备
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 构建pMAD△lmo1521重组质粒所用的特异性PCR引物
        4.1.4 仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA
        4.2.2 提取pET-28a(+)质粒DNA
        4.2.3 提取pMAD质粒DNA
        4.2.4 PCR扩增lmo1520、kanamycin及lmo1522基因
        4.2.5 SOE-PCR拼接lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段
        4.2.6 插入片段及连接载体的制备
        4.2.7 pMAD质粒与lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段的连接
        4.2.8 pMAD△lmo1521重组质粒的转化
        4.2.9 菌落PCR及双酶切验证pMAD△lmo1521重组质粒
    4.3 结果与分析
        4.3.1 SOE-PCR产物:lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段
        4.3.2 菌落PCR验证检测pMAD△lmo1521重组质粒
        4.3.3 pMAD△lmo1521重组质粒的双酶切验证
5 总结与展望
    5.1 总结
    5.2 论文创新点
    5.3 课题展望
参考文献
附录
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]单增李斯特菌在蜂产品中快速检测方法的建立及其自溶素基因lmo1521的功能鉴定[D]. 张红娟.中国计量学院 2012



本文编号：3669491