乳酸菌制剂制备及其在预防断奶仔猪腹泻中的初步应用

发布时间：2022-08-07 19:48

　　断奶仔猪腹泻（PWD）问题一直是养猪业的难题,每年都给全球经济造成巨大损失。目前主要是依靠抗生素防控PWD的发病率,并有明显下降。研究表明,益生菌作为补充剂添加到饲料中具有良好效果。但是,乳酸菌制剂存在作用效果较弱、保存困难等问题。因此,本试验旨在制备出优质的乳酸菌（SeAg-LAB）制剂及乳酸菌源硒、银的纳米颗粒（SeAg-NA）,增强乳酸菌制剂在临床中使用效果,提高仔猪机体免疫力,预防疾病发生。本研究首先对PWD流行病学调查,然后制备出SeAg-LAB、SeAg-NA,之后进行动物试验,分析SeAg-LAB、SeAg-NA的应用对ETEC K88感染引起的肠道损伤的保护作用。得出以下结果:流行病学研究调查显示,从黑龙江省断奶仔猪腹泻248份粪便样品中分离出238株致病性大肠杆菌。检测结果表明,F4、F18、F41阳性率分别为8.4%、11.34%、27.73%,STa、STb、EAST1阳性率分别为44.96%、28.15%、20.59%。与文献报道相比,F41菌毛基因的检出率增高,STa、STb等毒素基因检出率也在上升,但是不同国家不同地区毒力基因的检出率均存在差异性。生物被膜形... 

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摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 PWD的概述
        1.1.1 PWD危害
        1.1.2 PWD发病原因
        1.1.3 致病性大肠杆菌在PWD发生中的作用
    1.2 益生乳酸菌的功能
    1.3 乳酸菌制剂的保存进展
    1.4 乳酸菌制剂的应用
    1.5 研究的目的和意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 样品来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 试验菌株
        2.1.4 实验动物
        2.1.5 引物合成
        2.1.6 试验仪器和设备
    2.2 流行病学调查
        2.2.1 E.coli分离鉴定
        2.2.2 毒力基因的检测
        2.2.3 生物被膜形成能力测定
        2.2.4 药敏试验
        2.2.5 遗传分群
    2.3 适合用于纳米颗粒制备的乳酸菌菌株的筛选
        2.3.1 乳酸菌活化
        2.3.2 乳酸菌最适亚硒酸钠浓度的选择
        2.3.3 富硒能力强的乳酸菌菌株的初步筛选
        2.3.4 乳酸菌富硒能力的测定
        2.3.5 乳酸菌最适硝酸银浓度的选择
        2.3.6 富银能力强的乳酸菌菌株的初步筛选
        2.3.7 乳酸菌富银能力的测定
        2.3.8 富含单质硒、单质银的乳酸菌菌液的制备
    2.4 乳酸菌常温保存条件筛选
        2.4.1 常温保存冻干制剂配方的筛选
        2.4.2 乳酸菌制剂与菌液比例对乳酸菌冻干存活率的影响
        2.4.3 乳酸菌制剂冷冻干燥
        2.4.4 活菌计数及存活率的测定
    2.5 乳酸菌源Se-Ag纳米颗粒制备及其基本表征
        2.5.1 制备纳米颗粒
        2.5.2 电镜观察
        2.5.3 乳酸菌源SeAg-NA抑菌效果测定
    2.6 乳酸菌源SeAg-NA及 SeAg-LAB对小鼠的保护性试验
        2.6.1 菌株的准备及处理
        2.6.2 小鼠的保护性试验
        2.6.3 样品处理
    2.7 指标检测
        2.7.1 DAI的评估
        2.7.2 十二指肠细菌计数
        2.7.3 病理学检测
        2.7.4 DAO指标的检测
        2.7.5 检测抗氧化指标SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA含量变化
        2.7.6 检测细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、MPO含量变化
        2.7.7 实时定量PCR测定ZO-1、ocln、TLR-2、iNOS、cryptdin-1、mucin-2、CRS4C基因表达变化
    2.8 乳酸菌源SeAg-NA及 SeAg-LAB对仔猪的动物试验
    2.9 统计分析
3 结果
    3.1 流行病学调查结果
        3.1.1 E.coli分离鉴定结果
        3.1.2 毒力基因检测结果
        3.1.3 生物被膜形成能力检测结果
        3.1.4 药敏试验结果
        3.1.5 遗传分群结果
        3.1.6 致病性E.coli的特征及发生的变化
    3.2 适合用于乳酸菌源SeAg-NA制备的乳酸菌菌株的筛选
        3.2.1 乳酸菌最适亚硒酸钠浓度结果
        3.2.2 富硒能力强的乳酸菌菌株的初步筛选结果
        3.2.3 乳酸菌富硒能力的测定结果
        3.2.4 乳酸菌最适硝酸银浓度
        3.2.5 富银能力强的乳酸菌菌株的初步筛选结果
        3.2.6 乳酸菌在不同浓度下富银能力测定结果
    3.3 常温保存冻干保护剂结果
        3.3.1 乳酸菌保护剂配方筛选结果
        3.3.2 乳酸菌保护剂与菌液最佳比例的确定结果
        3.3.3 常温保存乳酸菌制剂的存活率测定结果
    3.4 纳米颗粒电镜结果
    3.5 乳酸菌源SeAg-NA的抑菌结果
    3.6 SeAg-NA及 SeAg-LAB对小鼠的保护试验结果
        3.6.1 DAI评分
        3.6.2 十二指肠细菌计数结果
        3.6.3 十二指肠病理结果
        3.6.4 DAO检测结果
        3.6.5 抗氧化指标SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA检测结果
        3.6.6 细胞因子IL-6、IL-10、IL-1β、MPO检测结果
        3.6.7 实时定量PCR测定ZO-1、ocln、TLR-2、iNOS、cryptdin-1、mucin-2、CRS4C结果
    3.7 乳酸菌源SeAg-NA及 SeAg-LAB对仔猪的促生长作用结果
4 讨论
    4.1 课题设计思路
    4.2 流行病学的研究
        4.2.1 毒力基因的特征
        4.2.2 生物被膜形成能力的特征
        4.2.3 耐药性的特征
        4.2.4 遗传分群的特征
    4.3 SeAg-LAB及乳酸菌源SeAg-NA的浓度分析
    4.4 乳酸菌制剂的优化条件对存活率的影响因素
    4.5 乳酸菌常温保存制剂的探索
    4.6 乳酸菌源SeAg-NA抑菌效果分析
    4.7 对小鼠保护性效果分析
        4.7.1 病理学分析
        4.7.2 抗氧化指标SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA含量对PWD分析
        4.7.3 细胞因子IL-10、IL-6、IL-1β 、MPO含量对PWD的分析
        4.7.4 实时定量PCR测定ZO-1、ocln、TLR-2、iNOS、cryptdin-1、mucin-2、CRS4C的结果对PWD分析
        4.7.5 乳酸菌源Se-Ag纳米颗粒ETEC K88 感染肠道损伤的保护作用
    4.8 对仔猪的保护性效果的分析
    4.9 乳酸菌制剂在临床上的应用
    4.10 下一步设想
5 结论
致谢
参考文献



本文编号：3670936