猪星状病毒新蛋白的初步鉴定
发布时间：2022-08-12 10:09
星状病毒（Astrovirus,AstV）是单股正义的RNA病毒,主要感染哺乳类和禽类动物,同时也是一种人畜共患病病毒。猪星状病毒在猪群中感染率较高,在世界各地均有分布。星状病毒变异较快,且诸多证据表明毒株之间可以发生重组。系统发育分析和蛋白解析发现,星状病毒是一种快速进化的病毒,它通过复制选择重组交换其衣壳的部分结构域,产生细胞嗜性的扩展。显然该病毒具有跨种间传播及适应新宿主的能力,与此同时星状病毒也有许多新型的临床症状,如脑炎、痛风等相关。本研究利用生物信息学的方法,对星状病毒中两个未知蛋白的结构和功能进行预测,并基于猪星状病毒反向遗传操作系统,探究两个蛋白对病毒生物学特性的影响。1.猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白的结构与功能预测及多克隆抗体的制备本研究通过生物信息学的方法对星状病毒的基因组进行分析,发现两个潜在的开放阅读框ORFX和ORFY,并对ORFX和ORFY编码的蛋白进行结构和功能的预测。ORFX与ORF2的5’端重叠,与ORF2的起始密码子间隔7个氨基酸;ORFY位于ORF2编码的保守区P1结构域,与ORF2的起始密码子间隔约299个氨基酸。利用蛋白质库和相关服务器对蛋...
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写对照表
第一章 文献综述
1.1 星状病毒的发现
1.2 星状病毒的分类
1.3 星状病毒的形态结构
1.4 星状病毒的基因组结构
1.5 星状病毒的蛋白特征
1.6 星状病毒的流行病学
1.6.1 人星状病毒
1.6.2 猪星状病毒
1.6.3 犬星状病毒
1.6.4 鸭星状病毒
1.7 星状病毒的发病机制
1.8 星状病毒的临床症状
1.9 星状病毒的检测方法
1.9.1 电子显微镜
1.9.2 病毒的分离与鉴定
1.9.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.9.4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.9.5 定量逆转录PCR(RT-qPCR)
1.9.6 高通量测序(High-throughputsequencing,HTS)
1.10 研究的目的与意义
第二章 猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白结构与功能的预测及多克隆抗体的制备
2.1 结果与分析
2.1.1 ORFX和ORFY蛋白质一级结构分析
2.1.2 ORFX和ORFY蛋白质二级结构分析
2.1.3 ORFX和ORFY蛋白质三级结构预测
2.2 讨论与小结
第三章 ORFX和ORFY蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
3.1 材料与方法
3.1.1 质粒和菌株
3.1.2 材料和试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要试剂配方
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 基因扩增
3.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
3.2.4 反应液回收
3.2.5 原核表达载体的酶切与鉴定
3.2.6 重组质粒的构建与鉴定
3.2.7 阳性克隆小量表达与鉴定
3.2.8 重组蛋白的大量表达
3.2.9 包涵体蛋白的洗涤与纯化
3.2.10 纯化蛋白的浓度测定
3.2.11 多克隆抗体的制备
3.2.12 IFA鉴定多克隆抗体的反应性
3.2.13 Western blotting检测多克隆抗体与蛋白的特异性
3.3 实验结果
3.3.1 基因扩增结果
3.3.2 重组质粒的鉴定
3.3.3 小量表达鉴定
3.3.4 IFA鉴定多克隆抗体反应性的结果
3.3.5 WB鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性
3.4 讨论与分析
第四章 pT7-ORFX和pT7-ORFY突变株的构建和拯救
4.1 实验材料
4.1.1 病毒与细胞
4.1.2 材料与试剂
4.2 实验方法
4.2.1 引物设计
4.2.2 基因片段克隆
4.2.3 突变株拯救
4.2.4 拯救毒株的鉴定
4.4 实验结果
4.4.1 基因定点突变克隆和测序结果
4.4.2 细胞病变观察
4.4.3 突变毒株的突变位点检测
4.4.4 拯救病毒的生长特性
4.4.5 间接免疫荧光鉴定结果
4.5 讨论与分析
第五章 全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]广西猪星状病毒分子流行病学调查[J]. 兰家暖,刘磊,郭旋,张民秀,卢冰霞,黄福标,覃熊慧,张宁,黄伟坚. 中国预防兽医学报. 2012(08)
[2]163例住院腹泻患儿粪便标本星状病毒检测[J]. 刘亚谊,乔海平,徐云鹤. 中国儿童保健杂志. 1999(03)
博士论文
[1]鸭星状病毒的遗传变异性和抗原性及感染鸭肝脏的转录组分析[D]. 刘宁.中国农业大学 2017
硕士论文
[1]2型猪圆环病毒衣壳蛋白的表达生产[D]. 陈小红.华东理工大学 2016
本文编号：3675685
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写对照表
第一章 文献综述
1.1 星状病毒的发现
1.2 星状病毒的分类
1.3 星状病毒的形态结构
1.4 星状病毒的基因组结构
1.5 星状病毒的蛋白特征
1.6 星状病毒的流行病学
1.6.1 人星状病毒
1.6.2 猪星状病毒
1.6.3 犬星状病毒
1.6.4 鸭星状病毒
1.7 星状病毒的发病机制
1.8 星状病毒的临床症状
1.9 星状病毒的检测方法
1.9.1 电子显微镜
1.9.2 病毒的分离与鉴定
1.9.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.9.4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.9.5 定量逆转录PCR(RT-qPCR)
1.9.6 高通量测序(High-throughputsequencing,HTS)
1.10 研究的目的与意义
第二章 猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白结构与功能的预测及多克隆抗体的制备
2.1 结果与分析
2.1.1 ORFX和ORFY蛋白质一级结构分析
2.1.2 ORFX和ORFY蛋白质二级结构分析
2.1.3 ORFX和ORFY蛋白质三级结构预测
2.2 讨论与小结
第三章 ORFX和ORFY蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
3.1 材料与方法
3.1.1 质粒和菌株
3.1.2 材料和试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要试剂配方
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 基因扩增
3.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
3.2.4 反应液回收
3.2.5 原核表达载体的酶切与鉴定
3.2.6 重组质粒的构建与鉴定
3.2.7 阳性克隆小量表达与鉴定
3.2.8 重组蛋白的大量表达
3.2.9 包涵体蛋白的洗涤与纯化
3.2.10 纯化蛋白的浓度测定
3.2.11 多克隆抗体的制备
3.2.12 IFA鉴定多克隆抗体的反应性
3.2.13 Western blotting检测多克隆抗体与蛋白的特异性
3.3 实验结果
3.3.1 基因扩增结果
3.3.2 重组质粒的鉴定
3.3.3 小量表达鉴定
3.3.4 IFA鉴定多克隆抗体反应性的结果
3.3.5 WB鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性
3.4 讨论与分析
第四章 pT7-ORFX和pT7-ORFY突变株的构建和拯救
4.1 实验材料
4.1.1 病毒与细胞
4.1.2 材料与试剂
4.2 实验方法
4.2.1 引物设计
4.2.2 基因片段克隆
4.2.3 突变株拯救
4.2.4 拯救毒株的鉴定
4.4 实验结果
4.4.1 基因定点突变克隆和测序结果
4.4.2 细胞病变观察
4.4.3 突变毒株的突变位点检测
4.4.4 拯救病毒的生长特性
4.4.5 间接免疫荧光鉴定结果
4.5 讨论与分析
第五章 全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]广西猪星状病毒分子流行病学调查[J]. 兰家暖,刘磊,郭旋,张民秀,卢冰霞,黄福标,覃熊慧,张宁,黄伟坚. 中国预防兽医学报. 2012(08)
[2]163例住院腹泻患儿粪便标本星状病毒检测[J]. 刘亚谊,乔海平,徐云鹤. 中国儿童保健杂志. 1999(03)
博士论文
[1]鸭星状病毒的遗传变异性和抗原性及感染鸭肝脏的转录组分析[D]. 刘宁.中国农业大学 2017
硕士论文
[1]2型猪圆环病毒衣壳蛋白的表达生产[D]. 陈小红.华东理工大学 2016
本文编号：3675685
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