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PEDV感染介导Vero E6细胞差异表达磷酸化蛋白筛选及功能解析

发布时间:2022-09-21 19:36
  猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种肠道接触性传染病,该病对哺乳仔猪的致死率高达90%。近年来,PEDV在世界范围内再次暴发,呈现明显的抬头趋势。磷酸化作用是瞬时蛋白质修饰最普遍形式,病毒利用宿主激酶系统对病毒蛋白质进行磷酸化修饰从而获得高效的感染及控制宿主先天免疫。然而,目前关于PEDV感染介导宿主细胞磷酸化蛋白变化的报道较少。本研究中,利用等重同位素多标签相对定量磷酸化蛋白质组学技术对PEDV感染的Vero E6细胞(V组,3个生物学重复)和PEDV未感染的Vero E6细胞(C组,3个生物学重复)差异表达的磷酸化蛋白进行筛选和功能解析。结果显示,在V组和C组中,鉴定磷酸化肽段总数2 385个,鉴定磷酸化蛋白数为1134个(已知磷酸化蛋白455个,未知磷酸化蛋白679个)。在V组和C组中一共存在109个差异表达磷酸化蛋白(p<0.05,V/C或C/V>1.5),其中,差异表达磷酸化蛋白中上调的磷酸化蛋白数为72... 

【文章页数】:107 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
中文摘要
英文摘要
1 文献综述
    1.1 猪流行性腹泻概述
        1.1.1 PED的流行
        1.1.2 PED的诊断
        1.1.3 PED的预防
        1.1.4 PED的治疗
    1.2 猪流行性腹泻病毒概述
        1.2.1 PEDV病毒学分类地位
        1.2.2 PEDV基因组结构
        1.2.3 PEDV编码的蛋白及功能
        1.2.4 PEDV的感染发生机制
    1.3 蛋白质组学技术
        1.3.1 蛋白质组学
        1.3.2 蛋白质组学在病毒学中的应用
        1.3.3 同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术
    1.4 磷酸化蛋白质组学技术
        1.4.1 蛋白质磷酸化的概况
        1.4.2 磷酸化蛋白样品的分离富集
        1.4.3 磷酸化蛋白位点鉴定与分析
        1.4.4 磷酸化蛋白质组学在病毒感染中的应用
    1.5 猪流行性腹泻感染相关蛋白研究进展
    1.6 本研究的目的意义
2 VeroE6细胞感染PEDV样品制备
    2.1 试验材料
        2.1.1 病毒与细胞
        2.1.2 主要生化试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 VeroE6细胞的培养
        2.2.2 Vero E6细胞样品制备
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PEDV感染VeroE6细胞样品的制备
        2.3.2 蛋白质浓度测定结果
        2.3.3 Westernblot鉴定PEDV感染VeroE6细胞
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 基于iTRAQ技术的VeroE6细胞差异表达磷酸化蛋白质组学研究
    3.1 试验材料
        3.1.1 主要生化试剂
        3.1.2 主要仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 酶解和肽段定量
        3.2.2 肽段标记
        3.2.3 二氧化钛富集
        3.2.4 质谱分析
        3.2.5 蛋白质鉴定与分析
        3.2.6 验证差异表达蛋白
        3.2.7 验证样品中Hsp70的表达
        3.2.8 细胞样品的制备、RNA的提取及实时荧光定量RT-PCR
    3.3 结果与分析
        3.3.1 酶解肽段浓度测定
        3.3.2 磷酸化蛋白质鉴定结果统计
        3.3.3 定量比值频数分布直方图
        3.3.4 差异表达磷酸化蛋白结果
        3.3.5 差异表达磷酸化蛋白质分子量分布
        3.3.6 差异表达磷酸化蛋白质等电点分布
        3.3.7 生物信息学(GO分析)
        3.3.8 差异表达磷酸化蛋白的KEGG通路和蛋白质相互作用网络调节
        3.3.9 差异表达蛋白验证
        3.3.10 Westernblot验证温度对Hsp70的影响
        3.3.11 荧光定量PCR鉴定PEDV的相对表达量
    3.4 讨论
        3.4.1 病毒感染相关信号通路
        3.4.2 差异磷酸化蛋白与病毒感染
    3.5 小结
4 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历


【参考文献】:
期刊论文
[1]天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在二氧化钛选择性富集磷酸肽中的应用[J]. 迟明,毕炜,卢庄,宋丽娜,贾伟,张养军,钱小红,蔡耘.  色谱. 2010(02)
[2]猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定[J]. 李宝贤,马广鹏,葛俊伟,李一经.  病毒学报. 2009(03)
[3]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力.  畜牧兽医学报. 2009(04)
[4]流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建[J]. 余丽芸,侯喜林.  动物医学进展. 2005(05)
[5]核不均一核糖核蛋白与病毒复制[J]. 冯晓辉,汤承,朱鑫,岳华.  畜牧兽医学报. 2015(06)
[6]猪流行性腹泻的免疫研究[J]. 钱永清,闻人楚,唐永兰,陈培龙,苏万国,许大新,张国强.  上海畜牧兽医通讯. 1999(03)
[7]应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 宣华,邢德坤,王殿瀛,朱维正,赵凤玉,巩怀俊,费思阁.  兽医大学学报. 1984(03)
[8]猪流行性腹泻病毒实验感染猪排毒规律的研究[J]. 王新平,朱维正.  兽医大学学报. 1988(01)

博士论文
[1]永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪轮状病毒对其影响的研究[D]. 王静.西北农林科技大学 2014
[2]猪流行性腹泻病毒AJ1102株的分离、鉴定及其分子进化特征[D]. 毕静.华中农业大学 2013

硕士论文
[1]上海地区PCV2分子流行病学及PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的磷酸化蛋白组学研究[D]. 石坤.中国农业科学院 2016
[2]猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响[D]. 高君恺.南京农业大学 2013
[3]猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究[D]. 张敏.华中农业大学 2010



本文编号:3680540

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