shRNA扰低水牛胎儿皮肤成纤维细胞Hlc基因表达的研究

发布时间：2022-09-29 20:50

　　参照Hlc基因序列设计干扰Hlc基因的干扰片段,构建表达载体,通过脂质体介导法,用构建的干扰质粒对水牛皮肤胎儿成纤维细胞的转染体系进行了优化,优化出的条件为质粒浓度2μg/ml、脂质体浓度5μl/ml、复合物共孵化时间30min,优化后的转染效率为30.87%。接着,通过脂质体将3个干扰水牛Hlc基因质粒和1个阴性对照质粒转入水牛胎儿皮肤成纤维细胞,并用qPCR检测了其转染24h和48h的水牛Hlc基因表达情况,以确定其干扰效果。结果表明,构建的3个干扰Hlc质粒都能在不同程度上下调水牛Hlc基因表达,而且在转染48h比转染24h下调水牛Hlc效果好。接着,为了研究下调Hlc表达后对水牛胎儿皮肤成纤维细胞生长的影响,将干扰质粒分别转染水牛胎儿皮肤成纤维细胞,观察转染后24h和48h的细胞生长状态。结果下调Hlc表达后,细胞生长受到抑制,甚至死亡,这表明水牛Hlc基因的表达对细胞生长分裂有着重要作用。随后,为了筛选出稳定转染的细胞,对培养至7代的水牛胎儿皮肤成纤维细胞进行杀稻瘟菌素药敏性检测,得到10天内杀死全部细胞的最低浓度为2.6μg/ml。用三种构建的干扰质粒通过脂质体以优化转染条... 

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文献综述
    第一节 RNAI研究进展
        1.1 RNAi的发现
        1.2 RNAi机制的研究
        1.3 RNAi特异性
        1.4 RNAi未来前景
    第二节 H1基因研究进展
        2.1 H1组蛋白家族
        2.2 H1结构和功能
        2.3 H1基因表达模式
    第三节 脂质体转染
        3.1 脂质体转染作用机制
        3.2 影响脂质体转染效率因素
    第四节 本研究的意义、目的与内容
        4.1 研究意义
        4.2 研究目的
        4.3 研究内容
第二部分 试验部分
    前言
    一 试验材料
        1 材料
        2 试剂配制
        3 主要仪器及设备
    二 试验方法
        1 干扰序列的设计与合成
        2 干扰载体的构建与验证
        3 质粒的扩增和提纯
        4 细胞培养
        5 脂质体转染细胞
        6 优化脂质体转染条件
        7 流式细胞仪检测
        8 RNA抽提
        9 反转录
        10 QPCR扩增
        11 细胞杀稻瘟菌素药敏性检测
        12 纯化转染细胞
        13 数据分析
    三 结果与分析
        1 质粒及对应的测序结果
        2 转染条件优化
        3 转染干扰质粒后对细胞Hlc的表达量的影响
        4 干扰Hlc基因表达对细胞的影响
        5 纯化转染细胞
    四 讨论
        1 干涉水牛胎儿皮肤成纤维细胞Hlc基因的表达
        2 优化脂质体转染条件
        3 干涉水牛胎儿皮肤成纤维细胞Hlc基因表达对细胞的影响
    五 小结
参考文献
附章
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]阳离子脂质体用做基因传递载体的研究进展[J]. 杨硕晔,陈西敬.  中国新药杂志. 2010(20)



本文编号：3683288