地衣芽孢杆菌CP-16降解羽毛关键酶高效表达研究

发布时间：2022-10-18 15:24

　　我国蛋白质饲料资源供求矛盾突出。每年产生大量羽、毛和蹄角等角蛋白资源,这些角蛋白富含二硫键、氢键及疏水基团,结构稳定不易被动物消化利用。物理、化学方法处理角蛋白存在能耗高、氨基酸破坏严重和环境污染等缺陷。高效生物降解更符合未来发展需求,打开二硫键,破坏角蛋白疏水结构是生物水解角蛋白的关键,实现打开这些化学键关键酶的高效表达对角蛋白生物处理产业化至关重要。本研究拟通过对地衣芽孢杆菌CP-16诱变（物理和化学）育种筛选获得具有高降解角蛋白效率正突变菌,为高效水解角蛋白奠定基础。同时,从CP-16中扩增出二硫键还原酶基因（Trx）、角蛋白酶基因（Ker）,构建获得2株枯草芽胞杆菌WB600降解羽毛关键酶重组菌（B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pTrx、B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pKer）。并分析不同信号肽对目的基因（Trx、Ker）分泌影响,随后对重组菌进行发酵条件优化,实现CP-16降解角蛋白关键酶量产,并应用于角蛋白生物酶解中。运用紫外、硫酸二乙酯对原始菌进行多轮物理和化学诱变,经初筛与复筛得到了羽毛降解关键酶高产正突变菌。经紫外诱变... 

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 角蛋白
        1.1.1 角蛋白组成与结构
        1.1.2 角蛋白利用
    1.2 角蛋白降解关键酶
        1.2.1 角蛋白酶
        1.2.2 二硫键还原酶
    1.3 传统微生物诱变育种
        1.3.1 紫外诱变
        1.3.2 化学诱变
        1.3.3 筛选方法
    1.4 枯草芽孢杆菌表达系统
        1.4.1 枯草芽孢杆菌表达系统研究现状
    1.5 影响外源蛋白在枯草芽孢杆菌分泌表达关键因素
        1.5.1 启动子选择
        1.5.2 高效信号肽筛选
        1.5.3 前导肽改造
        1.5.4 制备缺陷型宿主菌
        1.5.5 构建枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭系统
        1.5.6 提高载体与感受态转化效率
    1.6 研究目的与意义
    1.7 技术路线
第二章 地衣芽孢杆菌CP-16 诱变选育
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌种
        2.1.2 培养基和主要化学试剂的配制
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 菌株复苏和种子液制备
        2.1.5 地衣芽孢杆菌CP-16 紫外诱变
        2.1.6 地衣芽孢杆菌CP-16 化学诱变
        2.1.7 初筛
        2.1.8 复筛
        2.1.9 致死率计算
    2.2 结果与分析
        2.2.1 紫外线对菌株的诱变效应
        2.2.2 紫外诱变的初筛与复筛
        2.2.3 硫酸二乙酯对菌株的诱变效应
        2.2.4 硫酸二乙酯诱变的初筛与复筛
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 CP-16 羽毛降解关键基因枯草芽孢杆菌中的表达
    3.1 材料与方法
        3.1.1 菌株和载体
        3.1.2 工具酶和试剂
        3.1.3 培养基和主要化学试剂的配制
        3.1.4 主要仪器设备
        3.1.5 降解羽毛关键酶基因序列的克隆
        3.1.6 大肠杆菌感受态细胞的转化
        3.1.7 菌液PCR与基因测序
        3.1.8 重组质粒的小量提取及酶切鉴定
        3.1.9 枯草芽孢杆菌WB600 电转感受态细胞的制备与转化
        3.1.10 菌液PCR与基因测序
        3.1.11 酶活测定
    3.2 结果与分析
        3.2.1 CP-16 基因组DNA提取
        3.2.2 降解羽毛关键酶基因的克隆
        3.2.3 表达载体的构建
        3.2.4 重组菌株的表达
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 降解羽毛关键基因高效信号肽筛选
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌株和载体
        4.1.2 不同信号肽降解羽毛关键酶基因序列的克隆
        4.1.3 大肠杆菌感受态细胞的转化
        4.1.4 菌液PCR与基因测序
        4.1.5 枯草芽孢杆菌WB600 电转感受态细胞的制备与转化
        4.1.6 菌液PCR与基因测序
        4.1.7 酶活测定
    4.2 结果与分析
        4.2.1 无信号肽角蛋白酶基因的克隆
        4.2.2 无信号肽角蛋白酶基因重组枯草芽孢杆菌的表达分析
        4.2.3 含有不同信号肽二硫键还原酶、角蛋白酶基因的克隆
        4.2.4 含有不同信号肽二硫键还原酶、角蛋白酶基因重组表达分析
        4.2.5 二硫键还原酶、角蛋白酶酶活性的测定
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 重组菌发酵条件优化
    5.1 材料与方法
        5.1.1 菌种
        5.1.2 种子液制备
        5.1.3 诱导时机对重组菌产酶影响
        5.1.4 重组菌碳源优化
        5.1.5 不同碳源组合对重组菌产酶的影响
        5.1.6 重组菌氮源优化
        5.1.7 不同氮源组合对重组菌产酶的影响
        5.1.8 发酵时间对重组菌产酶的影响
        5.1.9 正交试验优化培养配方
    5.2 结果与分析
        5.2.1 诱导时机对重组菌产酶影响
        5.2.2 重组菌碳源优化
        5.2.3 不同碳源组合对重组菌产酶的影响
        5.2.4 不同碳源组合添加对重组菌产酶影响正交试验验证
        5.2.5 重组菌氮源优化
        5.2.6 不同氮源组合添加对重组菌产酶影响
        5.2.7 不同氮源组合添加对重组菌产酶影响正交试验验证
        5.2.8 发酵时间对重组菌产酶的影响
        5.2.9 正交试验优化培养配方
        5.2.10 正交试验优化培养配方结果验证
    5.3 讨论
    5.4 小结
第六章 全文结论
    6.1 主要结论
    6.2 创新点
    6.3 有待进一步解决的问题
参考文献
附录
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3692573