CRISPR/Cas9系统介导敲除CSN2基因奶山羊胎儿成纤维突变细胞的制备

发布时间：2022-10-18 16:44

　　旨在研究β-酪蛋白（β-casein,CSN2）对奶山羊泌乳性能的影响,利用CRISPR/Cas9系统敲除奶山羊胎儿成纤维细胞（GFFs）CSN2基因,为转基因动物模型构建提供核供体。针对CSN2第二号、八号外显子设计5个靶向CSN2基因sg RNA（T1、T2、T3、E1和E2）,与PX330-e GFP载体连接,构建PX330-e GFP-sg RNA敲除表达载体,经T7E I酶切实验评估敲除效率;选择第八号外显子敲除效率最高sg RNA,构建PX330-Neo-sg RNA敲除载体,将PX330-e GFP-sg RNA T及PX330-e GFP-sgRNAE与PX330-Neo-sgRNAE组合转染细胞,经流式分选、G418药筛获得敲除CSN2基因细胞。Western blot测定转染细胞CSN2表达情况。测序结果表明各sgRNA均正确连入PX330表达载体中,T7E 1酶切实验表明sg RNA T1、sgRNAE2敲除效率最高达34.9%和25.9%;经荧光定量PCR及免疫荧光检测结果表明,eGFP+Neo转染组CSN2敲除细胞比例显著高于e GFP+e GFP转染组（P＜... 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 仪器
        1.1.2 实验材料
    1.2 方法
        1.2.1 靶位点sg RNA的选择
        1.2.2 载体构建
        1.2.3 敲除效率鉴定
        1.2.4 Western blot检测
        1.2.5 PX330-Neo-sg RNA质粒构建及共转染
        1.2.6 荧光定量PCR
        1.2.7 细胞免疫荧光染色
2 结果
    2.1 PX330-e GFP-sg RNA载体构建
    2.2 敲除效率鉴定
    2.3 Western blot检测
    2.4 PX330-Neo-sg RNA载体构建
    2.5 长片段CSN2敲除细胞筛选
    2.6 荧光定量PCR检测
    2.7 免疫荧光检测
3 讨论
4 结论



本文编号：3692684