猪非典型瘟病毒的基因组序列分析及其N pro 蛋白的功能研究

发布时间：2022-10-19 10:05

　　猪非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus,APPV）是A-II型先天性震颤（Congenital tremor,CT）的主要病原体,主要引起新引进后备母猪所生产的第一窝仔猪震颤性疾病,临床症状表现为全身或者局部肌肉痉挛收缩并伴有共济失调。自2015年APPV首次在美国报道以来,迄今已经在全世界15个国家流行,给全球养猪业造成一定的经济损失。为研究APPV的遗传进化关系,本研究开展了中国部分地区APPV流行病学调查,进行了 APPV密码子使用模式分析。Npro是瘟病毒基因组翻译产生的第一个非结构蛋白,对病毒具有重要的生物学功能。该蛋白具有半胱氨酸蛋白酶活性,能够将其从翻译后的病毒多聚蛋白上自剪切出来,并进一步发挥病毒拮抗宿主天然免疫的作用。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒在感染宿主后能抑制机体的天然免疫反应,从而导致病毒的免疫逃逸和持续性感染。已有研究表明,Npro蛋白在这方面起到重要作用。然而,APPV作为新发现的瘟病毒,其Npro蛋白是否具有自剪切活性有待确定。同时,APPV的致病和免疫抑制机理均不清楚,解析Npro蛋白在天然免疫方面的作用将有助于阐述这些问题... 

【文章页数】：100 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
文献综述
    1 先天性震颤概述
    2 APPV的分子生物学特征及研究进展
        2.1 APPV分类
        2.2 APPV的生物学特性
        2.3 APPV的基因组结构
        2.4 APPV的主要蛋白
        2.5 病毒的进化
        2.6 流行病学
        2.7 传播途径
        2.8 APPV感染的免疫学特征
        2.9 临床症状和病理变化
        2.10 组织嗜性
        2.11 诊断
    3 研究目的及意义
研究内容
    第一章 APPV的分离鉴定及序列分析
        1 实验材料
            1.1 病料
            1.2 主要试剂
            1.3 主要试剂的配制
            1.4 主要仪器与设备
        2 试验方法
            2.1 引物设计
            2.2 感受态细胞top 10的制备
            2.3 病料处理
            2.4 RNA的提取
            2.5 cDNA的制备
            2.6 病毒检测及全基因组序列扩增
            2.7 PCR产物电泳检测及回收纯化
            2.8 DNA连接
            2.9 连接产物转化
            2.10 重组质粒的提取及鉴定
            2.11 测序及进化分析
        3 结果
            3.1 APPV检测结果
            3.2 APPV在中国的地理分布
            3.3 基于APPV-ORF,N~(pro)和E2基因的系统发育分析
        4 讨论
        5 小结
    第二章 APPV密码子使用模式分析
        1 实验材料
        2 试验方法
            2.1 重组分析和系统发育分析
            2.2 主成分分析
            2.3 成分和主要参数分析
            2.4 相对二核苷酸丰度分析
            2.5 相对同义密码子使用值
            2.6 有效密码子数分析
            2.7 ENC绘图分析
            2.8 中性分析
            2.9 偏倚分析
        3 结果
            3.1 重组分析、系统发育分析和主成分分析
            3.2 APPV的核苷酸组成
            3.3 RSCU分析
            3.4 相对二核苷酸丰度分析
            3.5 ENC分析
            3.6 ENC-plot关联分析
            3.7 中性分析
            3.8 PR2分析
        4 讨论
        5 小结
    第三章 APPV-Npro蛋白自剪切活性的研究
        1 材料
            1.1工具酶及主要试剂
            1.2 细胞、菌株及质粒载体
            1.3 主要试剂的配制
            1.4 主要仪器与设备
        2 试验方法
            2.1 引物的试剂与合成
            2.2 目的片段的扩增
            2.3 载体与目的片段双酶切
            2.4 重组真核表达质粒的构建
            2.5 重组质粒的提取与鉴定
            2.6 质粒的转染
            2.7 蛋白样品的收集和制备
            2.8 Western Blot检测
        3 结果
            3.1 鉴定重组质粒
            3.2 APPV-N~(pro)蛋白具有自剪切活性
            3.3 剪切位点突变对N~(pro)蛋白剪切活性的影响
            3.4 关键氨基酸突变对N~(pro)蛋白剪切活性的影响
            3.5 APPV-N~(pro)蛋白N端截短对N~(pro)蛋白剪切活性的影响
            3.6 APPV-N~(pro)蛋白C端截短对N~(pro)蛋白剪切活性的影响
        4 讨论
        5 小结
    第四章 APPV-Npro蛋白通过IRF3抑制IFN-β的产生
        1 材料
            1.1 工具酶及主要试剂
            1.2 细胞、菌株及质粒载体
            1.3 主要仪器与设备
        2 试验方法
            2.1 重组质粒构建
            2.2 质粒的转染
            2.3 RNA提取与反转录
            2.4 定量PCR检测
            2.5 启动子报告基因的检测
            2.6 免疫共沉淀(Co-IP)
            2.7 Western blot检测
            2.8 间接免疫荧光
            2.9 哺乳动物细胞双杂交
            2.10 数据分析
        3 结果
            3.1 APPV-N~(pro)蛋白对IFN-β产生的抑制
            3.2 多种天然免疫基因刺激下APPV-Npro蛋白对IRF3启动子活性的抑制
            3.3 APPV-N~(pro)蛋白与IRF3蛋白的相互作用
        4 讨论
        5 小结
全文结论
参考文献
附录一: APPV全长基因组序列详细信息
附录二: APPV-Npro蛋白基因序列详细信息
附录三: APPV-E2蛋白基因序列详细信息
攻读学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]一起猪非典型瘟病毒感染的诊断[J]. 周可磊,陈新诺,岳华,张斌.  动物医学进展. 2019(06)
[2]基于Erns蛋白的猪非典型瘟病毒间接ELISA检测方法的建立[J]. 黎振标,任旭皎,刘健新,鲁荣,李慧子,张彭涛,宁章勇.  中国动物传染病学报. 2020(03)
[3]基于猪非典型瘟病毒E2蛋白的间接ELISA检测方法的建立[J]. 黎振标,许古明,刘健新,任旭皎,鲁荣,李慧子,张彭涛,宁章勇.  中国兽医科学. 2019(01)



本文编号：3693160