美洲型及欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用
发布时间：2022-10-19 10:49
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种高度接触传染性病毒,妊娠母猪以及仔猪被感染后各自表现为繁殖障碍以及严重呼吸道疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。当前,PRRSVI临床流行毒株既有美洲型高致病性变异毒株、经典毒株,又有欧洲型毒株,并且流行毒株基因组仍在持续变异之中,给临床诊断造成极大的困难,亟需建立快速、特异的PRRSV鉴别检测方法。 1.美洲型和欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 根据GenBank中发表的PRRSV美洲型经典株VR-2332株、变异株JXAl以及欧洲型LV株的基因组序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计合成了3条TaqMan探针和2对特异性引物。经过反应条件的优化,建立了能同时检测PRRSV美洲型变异株、经典株以及欧洲型毒株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数都达到0.999以上；敏感性高,检测下限为2.68拷贝/μL,比普通R...
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要 ABSTRACT 第一章 综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征综述
1.1.1 病原学
1.1.2 基因组结构与功能
1.1.3 基因多样性及变异性
1.1.4 PRRSV的致病性特点
1.1.5 PRRSV检测技术及其研究进展
1.2 猪瘟概述
1.2.1 病原学
1.2.2 病毒基因组结构
1.2.3 CSFV检测方法
1.3 研究目的及意义
1.4 技术路线 第二章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
2.1 实验材料
2.1.1 病毒
2.1.2 主要实验试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 引物和探针的设计
2.2.2 重组质粒标准品的构建
2.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
2.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
2.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
2.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
2.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
2.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
2.3 结果
2.3.1 重组质粒标准品的制备
2.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
2.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
2.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
2.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
2.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
2.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
2.4 讨论 第三章 同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
3.1 实验材料
3.1.1 病毒
3.1.2 主要实验试剂
3.1.3 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 引物和探针的设计
3.2.2 重组质粒标准品的构建
3.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
3.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
3.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
3.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
3.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
3.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
3.3 结果
3.3.1 重组质粒标准品的制备
3.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
3.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
3.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
3.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
3.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
3.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
3.4 讨论 第四章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV以及CSFV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
4.1 实验材料
4.1.1 病毒
4.1.2 主要实验试剂
4.1.3 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 引物和探针的设计
4.2.2 重组质粒标准品的构建
4.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
4.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
4.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
4.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
4.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
4.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
4.3 结果
4.3.1 重组质粒标准品的制备
4.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
4.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
4.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
4.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
4.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
4.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
4.4 讨论 第五章 结论 参考文献 致谢 攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立[J]. 陈本龙,张立怀,王建华,王乃福. 中国动物检疫. 2013(11)
[2]IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量[J]. 李晶梅,朱薇,秦红刚,靖志强,廖园园,于义娟,肖敏,袁刚,谢红玲,漆世华,温文生. 中国兽药杂志. 2013(10)
[3]基于Taqman-MGB探针的猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法的研究[J]. 温国元,杨峻,罗青平,廖永洪,胡智斌,张蓉蓉,王红琳,艾地云,罗玲,宋念华,邵华斌. 中国猪业. 2013(S2)
[4]PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株qPCR区分方法的建立与应用[J]. 刘月月,陶海英,杜以军,王兴东,于江,赵鹏伟,刘思当,王金宝,吴家强. 家畜生态学报. 2013(04)
[5]猪瘟病毒通用型RT-LAMP方法的建立与应用[J]. 兰德松,闫明媚,赵凤菊,顾贵波. 现代畜牧兽医. 2013(04)
[6]猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展[J]. 张月,兰邹然,王贵升,孙圣福. 中国畜禽种业. 2012(10)
[7]同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 施开创,莫胜兰,张步娴,屈素洁,赵日浪,钟诚. 中国预防兽医学报. 2012(10)
[8]猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立[J]. 莫胜兰,施开创,胡杰,邹联斌,陆文俊,李军. 动物医学进展. 2012(09)
[9]高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究[J]. 范培虎,危艳武,郭龙军,吴洪丽,黄立平,刘长明. 中国农业科学. 2012(18)
[10]广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析[J]. 赵日浪,施开创,林昌华,赵国明,何贻坚,刘棋. 中国兽医科学. 2012(08)
硕士论文
[1]猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价[D]. 熊丁杰.四川农业大学 2010
[2]猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及猪瘟病毒对其的致病变作用[D]. 洪海霞.西北农林科技大学 2004
本文编号：3693225
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要 ABSTRACT 第一章 综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征综述
1.1.1 病原学
1.1.2 基因组结构与功能
1.1.3 基因多样性及变异性
1.1.4 PRRSV的致病性特点
1.1.5 PRRSV检测技术及其研究进展
1.2 猪瘟概述
1.2.1 病原学
1.2.2 病毒基因组结构
1.2.3 CSFV检测方法
1.3 研究目的及意义
1.4 技术路线 第二章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
2.1 实验材料
2.1.1 病毒
2.1.2 主要实验试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 引物和探针的设计
2.2.2 重组质粒标准品的构建
2.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
2.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
2.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
2.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
2.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
2.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
2.3 结果
2.3.1 重组质粒标准品的制备
2.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
2.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
2.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
2.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
2.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
2.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
2.4 讨论 第三章 同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
3.1 实验材料
3.1.1 病毒
3.1.2 主要实验试剂
3.1.3 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 引物和探针的设计
3.2.2 重组质粒标准品的构建
3.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
3.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
3.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
3.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
3.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
3.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
3.3 结果
3.3.1 重组质粒标准品的制备
3.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
3.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
3.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
3.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
3.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
3.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
3.4 讨论 第四章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV以及CSFV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
4.1 实验材料
4.1.1 病毒
4.1.2 主要实验试剂
4.1.3 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 引物和探针的设计
4.2.2 重组质粒标准品的构建
4.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化
4.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作
4.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验
4.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验
4.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验
4.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
4.3 结果
4.3.1 重组质粒标准品的制备
4.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定
4.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立
4.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析
4.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析
4.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析
4.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用
4.4 讨论 第五章 结论 参考文献 致谢 攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立[J]. 陈本龙,张立怀,王建华,王乃福. 中国动物检疫. 2013(11)
[2]IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量[J]. 李晶梅,朱薇,秦红刚,靖志强,廖园园,于义娟,肖敏,袁刚,谢红玲,漆世华,温文生. 中国兽药杂志. 2013(10)
[3]基于Taqman-MGB探针的猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法的研究[J]. 温国元,杨峻,罗青平,廖永洪,胡智斌,张蓉蓉,王红琳,艾地云,罗玲,宋念华,邵华斌. 中国猪业. 2013(S2)
[4]PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM-F92株qPCR区分方法的建立与应用[J]. 刘月月,陶海英,杜以军,王兴东,于江,赵鹏伟,刘思当,王金宝,吴家强. 家畜生态学报. 2013(04)
[5]猪瘟病毒通用型RT-LAMP方法的建立与应用[J]. 兰德松,闫明媚,赵凤菊,顾贵波. 现代畜牧兽医. 2013(04)
[6]猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展[J]. 张月,兰邹然,王贵升,孙圣福. 中国畜禽种业. 2012(10)
[7]同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 施开创,莫胜兰,张步娴,屈素洁,赵日浪,钟诚. 中国预防兽医学报. 2012(10)
[8]猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立[J]. 莫胜兰,施开创,胡杰,邹联斌,陆文俊,李军. 动物医学进展. 2012(09)
[9]高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究[J]. 范培虎,危艳武,郭龙军,吴洪丽,黄立平,刘长明. 中国农业科学. 2012(18)
[10]广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析[J]. 赵日浪,施开创,林昌华,赵国明,何贻坚,刘棋. 中国兽医科学. 2012(08)
硕士论文
[1]猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价[D]. 熊丁杰.四川农业大学 2010
[2]猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及猪瘟病毒对其的致病变作用[D]. 洪海霞.西北农林科技大学 2004
本文编号：3693225
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