副猪嗜血杆菌wza基因在其粘附和抗吞噬中的作用研究
发布时间：2022-10-20 13:32
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是猪群上呼吸道的条件性致病菌,在特定条件下可以引起以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的副猪嗜血杆菌病。HPS中wza基因编码的荚膜多糖输出蛋白在病原菌的致病过程中发挥重要的作用,本课题研究了HPS中荚膜多糖输出蛋白对其粘附及抗吞噬能力的影响,为阐明副猪嗜血杆菌定殖和扩散的分子机制提供理论基础。本课题主要取得的研究成果如下所示： 1、HPS荚膜多糖输出蛋白相关基因wza缺失株的构建 通过PCR的方法扩增wza基因的上下游同源臂片断,同时在上游同源臂5’端引物的和下游同源臂的3’端引物添加USS序列（ACCGCTTGT）,再扩增卡那抗性基因表达盒,将这三个片段用重叠PCR的方法拼接后,连接到自然转化载体pK18mobsacB得到重组质粒pK18-wza-UKD。将重组质粒自然转化入HPS FX0103中,通过kan抗性筛选得到wza基因缺失突变株FX0103-△wza,并对突变株用PCR、 RT-PCR、Southern Blot及Western Blot进行了鉴定。 2、HPS野生株FX0103与缺失...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1 副猪嗜血杆菌
1.1.2 副猪嗜血杆菌流行病学
1.1.3 副猪嗜血杆菌功能基因
1.2 荚膜多糖的研究进展
1.2.1 荚膜多糖的结构及组成
1.2.2 荚膜多糖与细菌的粘附相关
1.2.3 荚膜多糖与细菌的抗吞噬相关
2 研究的目的与意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 菌株、质粒载体和细胞
3.1.2 酶、试剂、试剂盒
3.1.3 培养基及抗生素的配制
3.1.4 引物
3.2 试验方法
3.2.1 副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取
3.2.2 自杀性质粒pK18-wza-UKD的构建
3.2.3 将自杀性质粒pK18-wza-UKD自然转化入副猪嗜血杆菌
3.2.4 wza基因缺失突变株的鉴定
3.2.5 生长曲线的测定
3.2.6 透射电子显微镜观察细菌的荚膜
3.2.7 检测副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza的荚膜多糖表达情况
3.2.8 FX0103和FX0103-△wza的血清分型试验
3.2.9 FX0103和FX0103-△wza与PK-15细胞作用后粘附能力的比较
3.2.10 小鼠单核巨噬细胞对FX0103和FX0103-△wza吞噬能力的比较
3.2.11 FX0103与FX0103-△wza被小鼠单核巨噬细胞吞噬后存活能力的比较
4 结果与分析
4.1 自然转化法筛选wza基因缺失突变株
4.1.1 自杀性质粒pK18-wza-UKD的构建
4.1.2 重组质粒pK18-wza-UKD自然转化入副猪嗜血杆菌
4.2 wza基因缺失突变株的鉴定
4.2.1 wza基因缺失突变株的PCR鉴定
4.2.2 wza基因缺失突变株的Southern Blot鉴定
4.2.3 RT-PCR检测极性效应
4.2.4 wza基因缺失突变株的Western Blot鉴定
4.3 野生株FX0103与基因缺失突变株FX0103-△wza生长曲线的绘制
4.4 透射电子显微镜观察细菌荚膜的形态
4.5 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza多糖的表达
4.5.1 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza总多糖的提取
4.5.2 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza胞外多糖的提取
4.6 FX0103和FX0103-△wza的血清分型试验
4.7 FX0103和FX0103-△wza与PK-15细胞作用后粘附能力的比较
4.8 FX0103和FX0103-△wza与小鼠单核巨噬细胞作用后抗吞噬能力的比较
4.9 FX0103和FX0103-△wza在小鼠单核巨噬细胞内存活能力的比较
5 讨论
5.1 自然转化法筛选副猪嗜血杆菌中wza基因缺失突变株
5.2 野生株与wza基因缺失突变株的生物学特性的比较
5.3 野生株和wza基因缺失突变株与猪肾上皮细胞(PK-15)的粘附能力
5.4 野生株和缺失株与小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的相互作用
6 小结
参考文献
致谢
本文编号：3694611
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1 副猪嗜血杆菌
1.1.2 副猪嗜血杆菌流行病学
1.1.3 副猪嗜血杆菌功能基因
1.2 荚膜多糖的研究进展
1.2.1 荚膜多糖的结构及组成
1.2.2 荚膜多糖与细菌的粘附相关
1.2.3 荚膜多糖与细菌的抗吞噬相关
2 研究的目的与意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 菌株、质粒载体和细胞
3.1.2 酶、试剂、试剂盒
3.1.3 培养基及抗生素的配制
3.1.4 引物
3.2 试验方法
3.2.1 副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取
3.2.2 自杀性质粒pK18-wza-UKD的构建
3.2.3 将自杀性质粒pK18-wza-UKD自然转化入副猪嗜血杆菌
3.2.4 wza基因缺失突变株的鉴定
3.2.5 生长曲线的测定
3.2.6 透射电子显微镜观察细菌的荚膜
3.2.7 检测副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza的荚膜多糖表达情况
3.2.8 FX0103和FX0103-△wza的血清分型试验
3.2.9 FX0103和FX0103-△wza与PK-15细胞作用后粘附能力的比较
3.2.10 小鼠单核巨噬细胞对FX0103和FX0103-△wza吞噬能力的比较
3.2.11 FX0103与FX0103-△wza被小鼠单核巨噬细胞吞噬后存活能力的比较
4 结果与分析
4.1 自然转化法筛选wza基因缺失突变株
4.1.1 自杀性质粒pK18-wza-UKD的构建
4.1.2 重组质粒pK18-wza-UKD自然转化入副猪嗜血杆菌
4.2 wza基因缺失突变株的鉴定
4.2.1 wza基因缺失突变株的PCR鉴定
4.2.2 wza基因缺失突变株的Southern Blot鉴定
4.2.3 RT-PCR检测极性效应
4.2.4 wza基因缺失突变株的Western Blot鉴定
4.3 野生株FX0103与基因缺失突变株FX0103-△wza生长曲线的绘制
4.4 透射电子显微镜观察细菌荚膜的形态
4.5 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza多糖的表达
4.5.1 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza总多糖的提取
4.5.2 副猪嗜血杆菌FX0103和FX0103-△wza胞外多糖的提取
4.6 FX0103和FX0103-△wza的血清分型试验
4.7 FX0103和FX0103-△wza与PK-15细胞作用后粘附能力的比较
4.8 FX0103和FX0103-△wza与小鼠单核巨噬细胞作用后抗吞噬能力的比较
4.9 FX0103和FX0103-△wza在小鼠单核巨噬细胞内存活能力的比较
5 讨论
5.1 自然转化法筛选副猪嗜血杆菌中wza基因缺失突变株
5.2 野生株与wza基因缺失突变株的生物学特性的比较
5.3 野生株和wza基因缺失突变株与猪肾上皮细胞(PK-15)的粘附能力
5.4 野生株和缺失株与小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的相互作用
6 小结
参考文献
致谢
本文编号：3694611
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3694611.html
