利用TALENs技术制备MSTN基因敲除的阿尔巴斯绒山羊

发布时间：2022-10-20 19:28

　　肌肉生成抑制素（Myostatin,MSTN）是骨骼肌生长发育的一个重要的负调控因子,是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员之一,具有抑制肌肉分化和生长的作用。研究表明通过遗传操作降低MSTN基因的表达能加速肌肉生长并增加产肉量。本研究首先构建了针对MSTN基因的TALENs载体,并利用标记蛋白表达载体优化了绒山羊胎儿成纤维细胞的脂质体共转染条件,然后利用最优的转染条件将TALENs载体导入阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞中,挑取转染后的单个细胞培养,建立单克隆细胞系,通过PCR鉴定筛选出MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞系。选择MSTN-/-基因型的细胞通过体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer, SCNT）的方法制备胚胎,移植受体后生产基因敲除的绒山羊。1、绒山羊胎儿成纤维细胞共转染条件的优化利用脂质体法将红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed质粒和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1质粒共同导入绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选最优的转染条件。在转染48h后,倒置荧光显微镜下可以观察到大量表达红色荧光和绿色荧光的阳性细胞并且细胞生长状... 

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分：实验部分
    第一章 胎儿成纤维细胞转染条件的优化
        1 材料
            1.1 化学试剂与实验材料
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的分离、培养
            2.2 脂质体法转染绒山羊胎儿成纤维细胞
            2.3 脂质体法转染条件的优化
        3 结果
            3.1 山羊胎儿成纤维细胞的分离、培养
            3.2 脂质体法转染条件的优化
        4 讨论
        参考文献
    第二章 利用TALENs技术制备MSTN基因敲除的绒山羊胎儿成纤维细胞
        1 材料
            1.1 化学试剂与实验材料
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 TALENs表达载体的构建
            2.2 荧光素酶检测载体对靶位点的切割效率
            2.3 TALENs表达载体的质量检测
            2.4 脂质体法转染阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞
            2.5 单克隆细胞系的获得
            2.6 单克隆细胞系基因组的提取
            2.7 阳性单克隆细胞系的鉴定
            2.8 双等位基因敲除细胞系染色体数目分析
        3 结果
            3.1 TALENs表达载体的构建
            3.2 荧光素酶检测结果
            3.3 TALENs表达载体的质量检测
            3.4 单克隆细胞系的获得
            3.5 阳性单克隆细胞系的鉴定
            3.6 双敲细胞系的染色体数目分析
        4 讨论
        参考文献
    第三章 MSTN基因敲除细胞系的核移植
        1 材料
            1.1 化学试剂与实验材料
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 卵母细胞的成熟培养
            2.2 供体细胞的准备
            2.3 核移植
            2.4 电融合
            2.5 重构胚的激活
            2.6 克隆胚胎的体外培养
            2.7 克隆胚胎移植及妊娠检查
        3 结果
            3.1 供体细胞的比较
            3.2 MSTN~(-/-)克隆胚胎的发育能力检测
            3.3 克隆胚胎移植及妊娠检查
        4 讨论
        参考文献
    结论
第二部分：综述部分
    参考文献
致谢
硕士期间论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同转染方法转染牛体细胞效率的比较[J]. 李松,丁方荣,戴蕴平,朱士恩.  农业生物技术学报. 2011(06)
[2]不同激活方法对绒山羊卵母细胞孤雌发育的影响[J]. 金永,袁建龙,朱兵,郭旭东,刘东军.  农业生物技术学报. 2011(03)
[3]奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究[J]. 张艳丽,许丹,庞训胜,万永杰,王子玉,孟立,宋辉,王锋.  南京农业大学学报. 2010(01)
[4]Effects of donor cells on in vitro development of cloned bovine embryos[J]. Jing Fu, Pengfei Guan, Leiwen Zhao, Hua Li, Shuzhen Huang, Fanyi Zeng *, Yitao Zeng * Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200040, China.  遗传学报. 2008(05)
[5]牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染[J]. 杨东山,杜晨光,高飞,旭日干.  动物学研究. 2006(01)
[6]利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎[J]. 张运海,潘登科,孙秀柱,孙国杰,王晓波,刘晓辉,李燕,戴蕴平,李宁.  中国科学C辑:生命科学. 2005(05)
[7]以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎[J]. 龚国春,戴蕴平,樊宝良,朱化彬,王海平,王莉莉,方昌阁,万荣,刘颖,李荣,李宁.  中国科学（C辑:生命科学）. 2003(06)



本文编号：3695162