多杀性巴氏杆菌△prfA突变株的构建及其生物学特性研究
发布时间：2022-10-21 12:51
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, P.multocida）是有荚膜的革兰氏阴性菌,该菌能引起禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎和兔出血性败血症等疾病,对动物养殖业造成很大的损失,此菌也可以感染人类,但是死亡率很低。采用选择性捕获转录序列技术筛选到PrfA参与多杀性巴氏杆菌的感染,可能是细菌重要的毒力因子。 本研究利用PCR扩增P.multocida C51-17株prfA基因的上、下游同源臂,将其克隆至质粒pBC-SK相应的酶切位点,构建重组质粒pBC-prfASX;将卡那霉素抗性基因表达盒克隆prfA的上、下游同源臂之间,构建自杀性质粒pBC-ΔprfA。将pBC-Δ prfA电转化至C51-17感受态细胞中,在抗性培养基上进行筛选,PCR和测序进一步验证成功构建了多杀性巴氏杆菌ΔprfA突变株。构建的ΔprfA突变株,具有良好的遗传稳定性；ΔprfA突变株的生化特性未发生改变,与亲本株一致。体外生长曲线显示,ΔprfA突变株和亲本株在37℃时的生长速度明显高于42℃培养条件下,ΔprfA突变株在37℃和42℃时的增殖速度均快于亲本株。在U...
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 多杀性巴氏杆菌的流行病学及危害
1.1.1 多杀性巴氏杆菌的流行特点
1.1.2 多杀性巴氏杆菌的危害
1.2 多杀性巴氏杆菌病的病原学
1.2.1 多杀性巴氏杆菌的血清型分型
1.2.2 多杀性巴氏杆菌的生长特性与理化特性
1.3 多杀性巴氏杆菌病的发病机理
1.4 多杀性巴氏杆菌病的临床症状
1.5 多杀性巴氏杆菌的检测方法
1.6 多杀性巴氏杆菌的致病机制
1.7 多杀性巴氏杆菌毒力因子
1.7.1 荚膜
1.7.2 外膜蛋白
1.7.3 脂多糖
1.7.4 皮肤坏死毒素
1.7.5 菌毛和粘附素
1.7.6 铁捕获蛋白
1.8 多杀性巴氏杆菌的抗生素耐药性
1.9 PrfA的调控作用
1.10 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株、质粒、细胞和实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 C51-17菌株基因组DNA的提取
2.2.2 引物设计
2.2.3 自杀性质粒的构建
2.2.4 C51-17菌株电转化感受态细胞的制备
2.2.5 自杀性质粒的电转化
2.2.6 ΔprfA突变株的筛选及鉴定
2.2.7 ΔprfA突变株的生物学特性鉴定
2.2.8 ΔprfA突变株的致病性试验
2.2.9 ΔprfA突变株粘附特性分析
2.2.10 PrfA对Hpt、PM209、RpoH的调控作用
3 结果与分析
3.1 prfA上下游同源臂的PCR扩增结果
3.2 自杀性质粒的酶切鉴定结果
3.3 ΔprfA突变株的PCR鉴定结果
3.4 ΔprfA突变株的生物学特性测定结果
3.4.1 生化特性检测结果
3.4.2 遗传稳定性检测结果
3.4.3 生长特性检测结果
3.5 ΔprfA突变株对小鼠的致病性结果
3.6 ΔprfA突变株的粘附试验结果
3.7 PrfA对Hpt、PM209、RpoH的调控结果
4 讨论
4.1 细菌基因突变策略
4.2 PrfA调控作用
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究[J]. 牛思博,姜志刚,德艳艳,于力. 中国预防兽医学报. 2013(05)
[2]兔巴氏杆菌病的类型与防治措施[J]. 于艳霞,宋长瑞,张新伟. 养殖技术顾问. 2012(12)
[3]动物源多杀性巴氏杆菌耐药性及耐药机制研究进展[J]. 孔令聪,战利,赵晴,高云航,马红霞. 中国兽药杂志. 2012(03)
[4]单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其生物学特性[J]. 白春光,殷月兰,贾艳艳,付红,高云飞,焦新安. 微生物学报. 2011(11)
[5]家兔巴氏杆菌病及其防治[J]. 冯小鹿. 农村科学实验. 2011(06)
[6]单核细胞增生李斯特菌SigmaB、PrfA因子对生物被膜形成影响的研究[J]. 张强,冯飞飞,王莉,冯莹颖,罗勤. 医学研究杂志. 2010(10)
[7]肠炎沙门氏菌rpoH基因缺陷株的构建及其热激响应特性[J]. 曾庆梅,张冬冬,韩抒,司文攻,李志强,魏春燕,吴聪,靳靖. 食品科学. 2009(11)
[8]细菌基因突变的策略及应用[J]. 黄勇. 微生物学通报. 2007(01)
[9]禽源多杀性巴氏杆菌（A:1）荚膜保护性抗原提纯及单克隆抗体细胞系建立[J]. 步恒富,马从林,刘■,邓定华. 兽医大学学报. 1990(03)
本文编号：3695678
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
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CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 多杀性巴氏杆菌的流行病学及危害
1.1.1 多杀性巴氏杆菌的流行特点
1.1.2 多杀性巴氏杆菌的危害
1.2 多杀性巴氏杆菌病的病原学
1.2.1 多杀性巴氏杆菌的血清型分型
1.2.2 多杀性巴氏杆菌的生长特性与理化特性
1.3 多杀性巴氏杆菌病的发病机理
1.4 多杀性巴氏杆菌病的临床症状
1.5 多杀性巴氏杆菌的检测方法
1.6 多杀性巴氏杆菌的致病机制
1.7 多杀性巴氏杆菌毒力因子
1.7.1 荚膜
1.7.2 外膜蛋白
1.7.3 脂多糖
1.7.4 皮肤坏死毒素
1.7.5 菌毛和粘附素
1.7.6 铁捕获蛋白
1.8 多杀性巴氏杆菌的抗生素耐药性
1.9 PrfA的调控作用
1.10 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株、质粒、细胞和实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 C51-17菌株基因组DNA的提取
2.2.2 引物设计
2.2.3 自杀性质粒的构建
2.2.4 C51-17菌株电转化感受态细胞的制备
2.2.5 自杀性质粒的电转化
2.2.6 ΔprfA突变株的筛选及鉴定
2.2.7 ΔprfA突变株的生物学特性鉴定
2.2.8 ΔprfA突变株的致病性试验
2.2.9 ΔprfA突变株粘附特性分析
2.2.10 PrfA对Hpt、PM209、RpoH的调控作用
3 结果与分析
3.1 prfA上下游同源臂的PCR扩增结果
3.2 自杀性质粒的酶切鉴定结果
3.3 ΔprfA突变株的PCR鉴定结果
3.4 ΔprfA突变株的生物学特性测定结果
3.4.1 生化特性检测结果
3.4.2 遗传稳定性检测结果
3.4.3 生长特性检测结果
3.5 ΔprfA突变株对小鼠的致病性结果
3.6 ΔprfA突变株的粘附试验结果
3.7 PrfA对Hpt、PM209、RpoH的调控结果
4 讨论
4.1 细菌基因突变策略
4.2 PrfA调控作用
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究[J]. 牛思博,姜志刚,德艳艳,于力. 中国预防兽医学报. 2013(05)
[2]兔巴氏杆菌病的类型与防治措施[J]. 于艳霞,宋长瑞,张新伟. 养殖技术顾问. 2012(12)
[3]动物源多杀性巴氏杆菌耐药性及耐药机制研究进展[J]. 孔令聪,战利,赵晴,高云航,马红霞. 中国兽药杂志. 2012(03)
[4]单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其生物学特性[J]. 白春光,殷月兰,贾艳艳,付红,高云飞,焦新安. 微生物学报. 2011(11)
[5]家兔巴氏杆菌病及其防治[J]. 冯小鹿. 农村科学实验. 2011(06)
[6]单核细胞增生李斯特菌SigmaB、PrfA因子对生物被膜形成影响的研究[J]. 张强,冯飞飞,王莉,冯莹颖,罗勤. 医学研究杂志. 2010(10)
[7]肠炎沙门氏菌rpoH基因缺陷株的构建及其热激响应特性[J]. 曾庆梅,张冬冬,韩抒,司文攻,李志强,魏春燕,吴聪,靳靖. 食品科学. 2009(11)
[8]细菌基因突变的策略及应用[J]. 黄勇. 微生物学通报. 2007(01)
[9]禽源多杀性巴氏杆菌（A:1）荚膜保护性抗原提纯及单克隆抗体细胞系建立[J]. 步恒富,马从林,刘■,邓定华. 兽医大学学报. 1990(03)
本文编号：3695678
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