兔原始生殖细胞体外培养条件的优化
发布时间：2022-10-29 19:33
原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）在胚胎和个体发育过程中,经不断分裂发育和分化演变为成体动物器官中的精子和卵细胞。体外分离培养兔PGCs是为胚胎早期发育机理、生殖细胞、细胞疫苗生产、永生化细胞等研究提供大量的细胞。但是,兔PGCs的体外培养方法、传代方法以及建系仍存在许多问题,影响了兔PGCs细胞的应用。兔PGCs体外培养的试验,除可解决这些问题外,也可为大家畜、实验动物的相关研究提供参考。所以建立稳定、高效的增殖传代兔PGCs的方法非常重要。本试验以兔16-20 d的胚胎为研究对象,比较了其胎龄、饲养层种类、饲养层密度、分离方法、传代方法及细胞因子等因素对PGCs分离培养的影响。改善兔PGCs体外分离培养的条件,提高兔PGCs集落数量和质量。为建立稳定的兔PGCs体外分离培养方法提供参考。试验主要结果如下:1.分离培养鼠、兔胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast,MEF、rabbit embryo fibroblast,REF）。选取昆明白近交系小鼠12-15 d胎鼠和日本大耳白兔16-18 d胎兔为材料,分离MEF、REF,...
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
文献综述
1 PGCs的起源、发生
2 PGCs谱系限定
3 PGCs的迁移
4 PGCs的研究进展
4.1 各种动物PGCs的研究现状
4.1.1 人
4.1.2 兔
4.1.3 小鼠
4.1.4 鸡
4.1.5 猪
4.1.6 牛
4.1.7 鱼
5 PGCs的生物学特性
5.1 PGCs的形态和生长特性
5.2 PGCs分化的全能性
6 PGCs的分离培养
6.1 PGCs的分离方法
6.2 PGCs的传代方法
7 PGCs的鉴定
7.1 形态学及生长行为鉴定
7.2 碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定
7.3 发育全能性标志基因的表达
8 影响PGCs体外分离培养的因素
8.1 胚胎日龄及获取PGCs的时间
8.2 分离培养方法
8.3 饲养层
8.3.1 饲养层细胞的种类
8.3.2 饲养层细胞的代数和接种密度
8.4 培养基
8.5 添加物
8.5.1 血清
8.5.2 细胞因子及生长因子
9 PGCs的意义及应用前景
试验一 鼠、兔胚胎成纤维细胞的分离培养
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器与设备
1.2 主要溶液配制
1.2.1 孕马血清促性腺激素(PMSG)注射液
1.2.2 人绒毛膜素性腺激素(HCG)注射液
1.2.3 1mol/L氢氧化钠的配制
1.2.4 1mol/L盐酸的配制
1.2.5 PBS缓冲液的配制
1.2.6 消化液的配制
1.2.7 胚胎成纤维细胞培养液的配制
1.2.8 FBS的分装与冻存
1.2.9 双抗的分装与冻存
1.2.10 冻存液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 试验动物超排
1.3.2 MEF、REF的分离培养
1.3.3 首次换液时间对MEF、REF的影响
1.3.4 MEF、REF的传代培养
1.3.5 MEF、REF细胞形态学观察
1.3.6 MEF、REF染色
1.3.7 MEF、REF生长曲线的绘制
1.3.8 MEF、REF的冻存与复苏
1.3.9 细胞计数
1.3.10 统计分析
2 结果与分析
2.1 MEF、REF生物学特性
2.2 首次换液时间对MEF、REF的影响
2.3 MEF、REF传代培养
2.4 MEF、REF染色结果
2.4.1 MEF、REF吉姆萨染色结果
2.4.2 MEF、REFHE染色结果
2.5 MEF、REF生长曲线的绘制
2.6 MEF、REF冻存不同时间的复苏效果
3 讨论
3.1 鼠、兔胚胎日龄与MEF、REF的关系
3.2 首次换液时间对MEF、REF的影响
3.3 MEF、REF的代数对细胞活力及生长曲线的影响
3.4 影响MEF、REF冻存、复苏的因素
4 小结
试验二 饲养层及传代方法对兔PGCs体外分离培养的影响
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器设备
1.2 主要溶液的配制
1.2.1 0.2mol/LL-谷氨酰胺存储液的配制
1.2.2 1mol/Lβ-巯基乙醇存储液的配制
1.2.3 100μg/mL丝裂霉素C的分装
1.2.4 FBS的分装与冻存
1.2.5 双抗的分装与冻存
1.2.6 明胶的配制
1.2.7 台盼蓝染色液的配制
1.2.8 PGCs培养液的配制
1.2.9 胚胎成纤维细胞培养液的配制
1.2.10 消化液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 兔PGCs分离培养
1.3.2 兔PGCs的传代培养
1.3.3 兔PGCs的鉴定
1.3.4 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
1.3.5 不同饲养层对兔PGCs的影响
1.3.6 不同分离方法对兔PGCs的影响
1.3.7 MEF、REF、混合饲养层活力的检测
1.3.8 不同传代方法对兔PGCs的影响
1.3.9 统计分析
2 结果与分析
2.1 不同日龄兔生殖嵴形态
2.2 兔PGCs的形态鉴定
2.2.1 兔PGCs的形态观察
2.2.2 兔PGCs生长行为的观察
2.2.3 兔PGCs碱性磷酸酶(AKP)染色
2.2.4 兔PGCsRT-PCR检测
2.3 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
2.3.1 兔PGCs在密度为5×104/mL和1×105/mL饲养层上的生长表现
2.3.2 兔PGCs在密度为5×105/mL饲养层上的生长表现
2.4 不同饲养层对兔PGCs的影响
2.4.1 MEF饲养层上兔PGCs的生长表现
2.4.2 REF饲养层上兔PGCs的生长表现
2.4.3 1:1、2:1、1:2混合饲养层上兔PGCs的生长表现
2.5 不同分离方法对兔PGCs的影响
2.6 P3代MEF、REF及混合饲养层活力的检测
2.6.1 MTT法检测饲养层活力
2.6.2 台盼蓝染色法检测MEF、REF、混合饲养层的活力
2.7 不同传代方法对兔PGCs的影响
3 讨论
3.1 不同胎龄对兔PGCs的影响
3.2 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
3.3 不同饲养层对兔PGCs的影响
3.4 不同分离方法对兔PGCs的影响
3.5 不同传代方法对兔PGCs的影响
4 小结
创新点
试验三 细胞因子对兔PGCs分离培养的影响
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器设备
1.2 主要溶液的配制
1.2.1 进口FBS的分装冻存
1.2.2 细胞因子的分装与保存
1.2.3 兔PGCs培养液的配制
1.2.4 不同浓度细胞因子兔PGCs细胞培养液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 REF饲养层的制作
1.3.2 兔PGCs的分离培养
1.3.3 兔PGCs的鉴定
1.3.4 不同培养液对兔PGCs的影响
1.3.5 统计分析
2 结果与分析
2.1 兔PGCs生长行为的观察
2.2 兔PGCs碱性磷酸酶(AKP)染色
2.3 兔PGCsRT-PCR检测
2.4 不同培养液对兔PGCs的影响
3 讨论
3.1 血清浓度对兔PGCs的影响
3.2 非细胞因子添加物对兔PGCs的影响
3.3 细胞因子及浓度对兔PGCs的影响
3.3.1 LIF
3.3.2 bFGF
3.3.3 TGF﹣β1
4 小结
创新点
参考文献
缩写词中英对照表
ABSTRACT
附件
本文编号：3698290
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
文献综述
1 PGCs的起源、发生
2 PGCs谱系限定
3 PGCs的迁移
4 PGCs的研究进展
4.1 各种动物PGCs的研究现状
4.1.1 人
4.1.2 兔
4.1.3 小鼠
4.1.4 鸡
4.1.5 猪
4.1.6 牛
4.1.7 鱼
5 PGCs的生物学特性
5.1 PGCs的形态和生长特性
5.2 PGCs分化的全能性
6 PGCs的分离培养
6.1 PGCs的分离方法
6.2 PGCs的传代方法
7 PGCs的鉴定
7.1 形态学及生长行为鉴定
7.2 碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定
7.3 发育全能性标志基因的表达
8 影响PGCs体外分离培养的因素
8.1 胚胎日龄及获取PGCs的时间
8.2 分离培养方法
8.3 饲养层
8.3.1 饲养层细胞的种类
8.3.2 饲养层细胞的代数和接种密度
8.4 培养基
8.5 添加物
8.5.1 血清
8.5.2 细胞因子及生长因子
9 PGCs的意义及应用前景
试验一 鼠、兔胚胎成纤维细胞的分离培养
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器与设备
1.2 主要溶液配制
1.2.1 孕马血清促性腺激素(PMSG)注射液
1.2.2 人绒毛膜素性腺激素(HCG)注射液
1.2.3 1mol/L氢氧化钠的配制
1.2.4 1mol/L盐酸的配制
1.2.5 PBS缓冲液的配制
1.2.6 消化液的配制
1.2.7 胚胎成纤维细胞培养液的配制
1.2.8 FBS的分装与冻存
1.2.9 双抗的分装与冻存
1.2.10 冻存液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 试验动物超排
1.3.2 MEF、REF的分离培养
1.3.3 首次换液时间对MEF、REF的影响
1.3.4 MEF、REF的传代培养
1.3.5 MEF、REF细胞形态学观察
1.3.6 MEF、REF染色
1.3.7 MEF、REF生长曲线的绘制
1.3.8 MEF、REF的冻存与复苏
1.3.9 细胞计数
1.3.10 统计分析
2 结果与分析
2.1 MEF、REF生物学特性
2.2 首次换液时间对MEF、REF的影响
2.3 MEF、REF传代培养
2.4 MEF、REF染色结果
2.4.1 MEF、REF吉姆萨染色结果
2.4.2 MEF、REFHE染色结果
2.5 MEF、REF生长曲线的绘制
2.6 MEF、REF冻存不同时间的复苏效果
3 讨论
3.1 鼠、兔胚胎日龄与MEF、REF的关系
3.2 首次换液时间对MEF、REF的影响
3.3 MEF、REF的代数对细胞活力及生长曲线的影响
3.4 影响MEF、REF冻存、复苏的因素
4 小结
试验二 饲养层及传代方法对兔PGCs体外分离培养的影响
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器设备
1.2 主要溶液的配制
1.2.1 0.2mol/LL-谷氨酰胺存储液的配制
1.2.2 1mol/Lβ-巯基乙醇存储液的配制
1.2.3 100μg/mL丝裂霉素C的分装
1.2.4 FBS的分装与冻存
1.2.5 双抗的分装与冻存
1.2.6 明胶的配制
1.2.7 台盼蓝染色液的配制
1.2.8 PGCs培养液的配制
1.2.9 胚胎成纤维细胞培养液的配制
1.2.10 消化液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 兔PGCs分离培养
1.3.2 兔PGCs的传代培养
1.3.3 兔PGCs的鉴定
1.3.4 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
1.3.5 不同饲养层对兔PGCs的影响
1.3.6 不同分离方法对兔PGCs的影响
1.3.7 MEF、REF、混合饲养层活力的检测
1.3.8 不同传代方法对兔PGCs的影响
1.3.9 统计分析
2 结果与分析
2.1 不同日龄兔生殖嵴形态
2.2 兔PGCs的形态鉴定
2.2.1 兔PGCs的形态观察
2.2.2 兔PGCs生长行为的观察
2.2.3 兔PGCs碱性磷酸酶(AKP)染色
2.2.4 兔PGCsRT-PCR检测
2.3 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
2.3.1 兔PGCs在密度为5×104/mL和1×105/mL饲养层上的生长表现
2.3.2 兔PGCs在密度为5×105/mL饲养层上的生长表现
2.4 不同饲养层对兔PGCs的影响
2.4.1 MEF饲养层上兔PGCs的生长表现
2.4.2 REF饲养层上兔PGCs的生长表现
2.4.3 1:1、2:1、1:2混合饲养层上兔PGCs的生长表现
2.5 不同分离方法对兔PGCs的影响
2.6 P3代MEF、REF及混合饲养层活力的检测
2.6.1 MTT法检测饲养层活力
2.6.2 台盼蓝染色法检测MEF、REF、混合饲养层的活力
2.7 不同传代方法对兔PGCs的影响
3 讨论
3.1 不同胎龄对兔PGCs的影响
3.2 不同密度饲养层对兔PGCs的影响
3.3 不同饲养层对兔PGCs的影响
3.4 不同分离方法对兔PGCs的影响
3.5 不同传代方法对兔PGCs的影响
4 小结
创新点
试验三 细胞因子对兔PGCs分离培养的影响
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器设备
1.2 主要溶液的配制
1.2.1 进口FBS的分装冻存
1.2.2 细胞因子的分装与保存
1.2.3 兔PGCs培养液的配制
1.2.4 不同浓度细胞因子兔PGCs细胞培养液的配制
1.3 试验方法
1.3.1 REF饲养层的制作
1.3.2 兔PGCs的分离培养
1.3.3 兔PGCs的鉴定
1.3.4 不同培养液对兔PGCs的影响
1.3.5 统计分析
2 结果与分析
2.1 兔PGCs生长行为的观察
2.2 兔PGCs碱性磷酸酶(AKP)染色
2.3 兔PGCsRT-PCR检测
2.4 不同培养液对兔PGCs的影响
3 讨论
3.1 血清浓度对兔PGCs的影响
3.2 非细胞因子添加物对兔PGCs的影响
3.3 细胞因子及浓度对兔PGCs的影响
3.3.1 LIF
3.3.2 bFGF
3.3.3 TGF﹣β1
4 小结
创新点
参考文献
缩写词中英对照表
ABSTRACT
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本文编号：3698290
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