绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白与绵羊透明质酸酶2相互作用初探

发布时间：2022-10-31 19:45

　　研究背景：绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis, OPA）是由绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV）引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病。JSRV为p反转录病毒属成员,其env基因主要编码囊膜蛋白（JSRV-Env）,包括表面蛋白（SU）和穿膜蛋白（TM）两个亚基。有研究表明,绵羊透明质酸酶2（hyaluronidase2, Hyal-2）在绵羊体内作为内、外源性JSRV细胞受体起作用。但有关绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基之间相互作用的研究资料尚比较缺乏。 研究目的：绵羊Hyal-2作为JSRV进入绵羊机体细胞的受体起作用,因此,深入研究绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基（SU、TM）之间的相互作用,对于揭不JSRV侵染细胞及致瘤机理具有重要意义。 研究方法： （1）运用重叠PCR方法扩增绵羊透明质酸酶2基因（hyal-2）,并运用生物信息学软件对其表达蛋白结构进行预测。 （2）构建绵羊透明质酸酶2（Hyal-2）的真核表达载体,为后期建立相关稳定表达细胞系及进行病毒感染... 

【文章页数】：145 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
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插图和附表清单
缩略词表
1 引言
    1.1 逆转录病毒概述
        1.1.1 基因组的组成
        1.1.2 生命周期
    1.2 内源性逆转录病毒
        1.2.1 基因组组成
        1.2.2 ERVs在细胞抵抗外源性感染过程中的作用
        1.2.3 ERVs在人类胎盘形成中的作用
    1.3 绵羊肺腺瘤逆转录病毒(JSRV)
        1.3.1 OPA的发现及命名
        1.3.2 OPA的病原的确定
        1.3.3 OPA的临床症状及病理变化
        1.3.4 OPA的临床诊断
        1.3.5 OPA的控制和治疗
        1.3.6 OPA的流行病学特点
        1.3.7 JSRV基因组组成
    1.4 JSRV与受体相互作用
    1.5 内源性JSRV(enJSRV)
        1.5.1 enJSRV的概述
        1.5.2 enJSRVs在生殖道中的表达
    1.6 绵羊透明质酸酶2(Hyal-2)的作用
        1.6.1 透明质酸酶简介
        1.6.2 透明质酸酶2的作用
    1.7 JSRV及enJSRV的相互作用
    1.8 JSRV的Env蛋白转化细胞的不同机制
    1.9 参与JSRV Env介导细胞转化信号通路
        1.9.1 PI3K依赖和非依赖型蛋白激酶通路
        1.9.2 Raf-MEK-MAPK途径
        1.9.3 RON-Hyal-2途径
    1.10 巢式PCR
    1.11 重叠PCR技术
        1.11.1 重叠PCR技术
        1.11.2 重叠PCR技术原理
    1.12 蛋白相互作用研究方法
        1.12.1 蛋白质亲和色谱
        1.12.2 GST pull down技术
        1.12.3 酵母双杂交技术
        1.12.4 免疫共沉淀技术
        1.12.5 荧光共振能量转移技术
        1.12.6 双分子荧光互补技术
    1.13 真核细胞转染技术
    1.14 研究目的及意义
2 实验一 绵羊透明质酸酶2的基因扩增与序列分析
    摘要
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 连接反应
        2.1.4 转化感受态细胞
        2.1.5 菌液PCR鉴定
        2.1.6 双酶切鉴定
        2.1.7 DNA序列测定与分析
    2.2 结果
        2.2.1 重叠PCR(overlapping PCR)扩增hyal-2基因
        2.2.2 hyal-2克隆载体的构建及鉴定
        2.2.3 DNA序列测定与分析
        2.2.4 生物信息学分析
    2.3 讨论
    2.4 结论
3 实验二 绵羊透明质酸酶2的真核表达及鉴定
    摘要
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 结果
        3.2.1 PCR(overlapping PCR)扩增hyal-2基因
        3.2.2 hyal-2真核表达载体的构建及鉴定
    3.3 讨论
    3.4 结论
4 实验三 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其亚基真核表达载体的构建及表达产物鉴定
    摘要
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果
        4.2.1 含绿色荧光蛋白标记的绵羊Env真核表达载体的构建
        4.2.2 含绿色荧光蛋白标记的SU及TM真核表达载体的构建
        4.2.3 激光共聚焦显微镜观察结果
        4.2.4 Western-blotting鉴定结果
    4.3 讨论
    4.4 结论
5 实验四 绵羊透明质酸酶2与绵羊肺腺瘤囊膜蛋白及其亚基相互作用的研究
    摘要
    5.1 免疫共沉淀方法的检测
        5.1.1 材料与方法
        5.1.2 结果
    5.2 双分子荧光互补技术检测Env及其亚基与Hyal-2的相互作用
        5.2.1 材料与方法
        5.2.2 结果
    5.3 讨论
    5.4 结论
6 实验五 SU蛋白与Hyal-2蛋白可能结合区域的研究
    摘要
    6.1 免疫共沉淀方法检测缺失型SU蛋白与Hyal-2相互作用
        6.1.1 材料与方法
        6.1.2 结果
    6.2 双分子荧光互补技术检测可能的结合区域
        6.2.1 材料与方法
        6.2.2 结果
    6.3 讨论
    6.4 结论
7 实验六 pEGFP-C1-(env、su、tm)与 pDsRechnonomer-N1-hyal/-2共转小鼠 NIH3T3细胞后对pik3ca、ras基因表达量变化的影响
    摘要
    7.1 材料与方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 方法
    7.2 结果
        7.2.1 实时荧光定量PCR检测单独转染env及其亚基真核表达载体后对pik3ca基因和ras基因mRNA表达的影响
        7.2.2 检测单独转染env及其亚基真核表达载体后对pik3ca基因和ras基因mRNA表达的影响
        7.2.3 实时荧光定量PCR检测分别共转染env及其亚基与hya1-2真核表达载体后对pik3ca基因和ras基因mRNA表达的影响
    7.3 讨论
    7.4 结论
8 全文结论与创新点
    8.1 全文结论
    8.2 创新点
    8.3 研究展望
致谢
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较[J]. 涂占晗,林旭.  中国当代医药. 2012(14)
[2]绵羊肺腺瘤病[J]. 荆文魁,王颖,张怀宇,刘彩霞.  中国兽医杂志. 2010(05)
[3]HYAL2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响[J]. 周敏,周琦,李少林,唐良萏,赵迎泽.  第四军医大学学报. 2009(23)
[4]双分子荧光互补技术[J]. 樊晋宇,崔宗强,张先恩.  中国生物化学与分子生物学报. 2008(08)
[5]透明质酸及透明质酸酶与肿瘤的关系[J]. 曲蕾,姬胜利.  中国生化药物杂志. 2007(02)
[6]不同转染方法及GFP表达载体对小鼠胚胎干细胞转染效率的比较[J]. 陈红,钱坤,张苏明.  华中科技大学学报(医学版). 2006(04)
[7]绵羊肺腺瘤病[J]. 宋卓.  畜牧兽医科技信息. 2006(04)
[8]透明质酸酶研究进展[J]. 李顺意,梁宋平.  国外医学(分子生物学分册). 1995(02)

硕士论文
[1]绵羊肺腺瘤病的病理组织学研究[D]. 郑秉武.内蒙古农业大学 2006



本文编号：3699607