利用同源重组构建Chordin、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

发布时间：2022-11-03 23:26

　　实验旨在构建敖汉细毛羊Chordin、BMP6基因表达载体,以及将其单、共转染至成纤维细胞中,分析mRNA、蛋白表达量的变化并探究两基因间的相互作用。采集40日龄的胎羊皮肤组织样品,通过PCR反应扩增目的基因（Chordin、BMP6基因）片段,利用SoSo试剂盒将目的片段与表达载体pcDNA3.1连接。鉴定正确后,将pcDNA3.1-Chordin和pcDNA3.1-BMP6转化至大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞振荡培养。提取质粒,将构建好的质粒pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6单、共转染至成纤维细胞中。通过荧光定量PCR和Western Blot技术检测Chordin和BMP6转染后表达量的变化并探究两基因间的作用关系。结果表明:利用同源重组技术成功构建了Chordin、BMP6基因的表达载体,共转染成纤维细胞后Chordin基因的表达量明显升高且共转染组的表达量极显著高于单转染组,BMP6基因的表达量明显下降,且共转染组的表达量极显著低于单转染组。Chordin基因抑制了BMP6基因的表达,BMP6基因促进了Chordin基因的表达。 

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验材料
    1.2 实验方法
        1.2.1 引物设计
        1.2.2 Chordin、BMP6基因与pcDNA3.1质粒同源重组对pcDNA3.1质粒进行EcoR I、Kpn I单酶切，酶切体系：
        1.2.3 成纤维细胞的培养
        1.2.4 细胞转染
        1.2.5 细胞转染后的RT-PCR扩大培养转染成功的单细胞
        1.2.6 细胞转染后Western Blot检测蛋白表达
2 结果
    2.1 目的基因扩增
    2.2 pcDNA3.1载体单酶切及纯化
    2.3 表达载体pcDNA3.1与目的片段重组及鉴定
    2.4 细胞培养
    2.5 实时荧光定量PCR检测mRNA的表达
    2.6 Westren Blot检测蛋白的表达
3 讨论
4 结论


【参考文献】：
期刊论文
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[2]利用同源重组构建BMP6基因真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国畜牧杂志. 2018(08)
[3]敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,程明,王国义,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国畜牧兽医. 2018(01)
[4]BMPR1B基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状关系的研究[J]. 王小佳,贺建宁,程明,刘开东,刘积凤,柳楠.  中国畜牧杂志. 2017(01)
[5]敖汉细毛羊不同部位皮肤毛囊发育及形态结构研究[J]. 柳楠,王春亮,贺建宁,程明,刘开东,刘积凤,赵金山.  中国畜牧杂志. 2015(17)
[6]绵羊骨形态发生蛋白4（BMP4）的生物信息学分析[J]. 樊振华,张秋月,范瑞文,任玉红.  中国畜牧兽医. 2015(06)
[7]Hox基因家族对细毛羊羊毛性状影响的研究[J]. 柳楠,卜然,贺建宁,程明,刘开东,刘积凤,赵金山.  中国畜牧杂志. 2014(23)
[8]内蒙古绒山羊毛囊不同发育时期BMP2、Noggin及SHH基因在皮肤中的表达[J]. 苏蕊,张文广,常子丽,王瑞军,李金泉.  扬州大学学报(农业与生命科学版). 2009(01)
[9]敖汉细毛羊品种形成与发展前景[J]. 刘海山,李恒荣,于洪杰,刘俊茹,张富.  当代畜禽养殖业. 2001(08)

硕士论文
[1]草鱼抗病毒转基因P0代的构建和鱼类Chordin基因的克隆及其对金鱼尾型的影响[D]. 秦波.上海海洋大学 2015



本文编号：3700822