重组气肿疽梭菌CctA基因在大肠杆菌中的表达及免疫原性初步研究

发布时间：2022-12-03 20:28

　　目的:气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）是最具致病性的梭菌之一,主要引起气肿疽,也称为黑腿病,该病具有高致死率,在全球范围内造成畜牧业生产的重大损失。气肿疽梭菌细胞毒素（CctA）是其产生的五种毒素中最典型的致病性毒素,具有细胞毒性和溶血活性,是主要的保护性抗原,在致病性中起着主导作用,成为黑腿病疫苗的一个有价值的候选抗原。本试验通过对气肿疽梭菌CctA全长基因进行生物信息学分析,构建截短CctA基因原核表达质粒并诱导蛋白表达,制备亚单位疫苗免疫豚鼠,建立间接ELISA方法检测豚鼠体内抗体水平,对亚单位疫苗的免疫效果进行初步分析。方法:1.根据公布的CctA基因序列设计特异性引物并合成。利用生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA蛋白的结构和功能、糖基化位点、优势抗原表位等进行预测。2.根据生物信息学分析结果,合成CctA全长基因去除信号肽及部分序列的片段。将截短CctA基因经pMD19-T克隆后插入原核表达载体pET-28a（+）,转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞,利用... 

【文章页数】：61 页

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Abstract
英文缩略词表
第一章 绪论 气肿疽梭菌研究进展
    1 病原学
    2 流行病学
        2.1 传染源
        2.2 传播途径
        2.3 易感动物
        2.4 流行现状
    3 主要毒力因子
        3.1 细胞毒素
        3.2 鞭毛蛋白
        3.3 透明质酸酶
        3.4 神经氨酸酶
        3.5 DNAse
    4 临床症状及病理变化
    5 诊断方法
    6 疫苗研究进展
    7 小结
第二章 试验内容
    试验一 CctA全长基因的扩增及生物信息学分析
        1 材料
            1.1 试验材料及试剂
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 引物的设计与合成
            2.2 CctA全长基因的扩增
            2.3 CctA蛋白的相关生物信息学分析
        3 结果与分析
            3.1 气肿疽梭菌CctA全长基因PCR扩增结果
            3.2 CctA蛋白的结构和功能预测
                3.2.1 CctA蛋白的理化性质分析
                3.2.2 CctA蛋白氨基酸序列的亲疏水性分析
                3.2.3 CctA蛋白的结构预测
                3.2.4 CctA蛋白糖基化及磷酸化位点的预测
                3.2.5 CctA蛋白的二级、三级结构预测
                3.2.6 CctA蛋白潜在抗原表位的预测
        4 讨论
    试验二 截短CctA基因在大肠杆菌中的表达与纯化
        1 材料
            1.1 试验菌株及载体
            1.2 主要试剂
            1.3 主要培养基及试剂的配制
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 截短CctA基因的扩增
            2.2 重组pMD19-T-CctA克隆质粒的构建与鉴定
                2.2.1 PCR产物的纯化
                2.2.2 目的基因与pMD19-T载体连接
                2.2.3 连接产物的转化
                2.2.4 重组克隆质粒的提取
                2.2.5 重组克隆质粒的鉴定
            2.3 重组pET-28a(+)-CctA表达质粒的构建与鉴定
                2.3.1 重组克隆质粒与表达载体pET-28a(+)的双酶切与回收
                2.3.2 目的片段与表达质粒pET-28a(+)的连接
                2.3.3 重组表达质粒的转化
                2.3.4 重组表达质粒的鉴定
            2.4 重组蛋白的诱导表达及扩大培养
            2.5 重组蛋白的纯化
            2.6 重组蛋白Western blot反应原性检测
            2.7 包涵体蛋白的复性
        3 结果与分析
            3.1 截短CctA基因扩增结果
            3.2 CctA基因重组克隆质粒的PCR鉴定
            3.3 CctA基因重组表达质粒的酶切鉴定
            3.4 重组表达菌的诱导表达
            3.5 重组蛋白大量诱导结果
            3.6 重组蛋白的纯化
            3.7 重组蛋白的Western blot分析
            3.8 包涵体蛋白复性结果
        4 讨论
    试验三 重组CctA免疫原性初步研究
        1 材料
            1.1 菌种、佐剂及主要实验试剂
            1.2 主要试剂与培养基配制
            1.3 试验动物
            1.4 主要耗材及仪器
        2 方法
            2.1 重组蛋白的灭活检验及疫苗配制
            2.2 动物免疫试验
            2.3 攻毒保护试验
                2.3.1 攻毒用强毒的制备
                2.3.2 攻毒用强毒菌液的毒力测定
                2.3.3 攻毒试验
            2.4 间接ELISA检测方法的建立
                2.4.1 ELISA反应条件的筛选
                2.4.2 最佳反应条件的确定
                2.4.3 阴阳性判定标准确定
            2.5 间接ELISA方法检测抗体水平
        3 结果与分析
            3.1 灭活检验结果
            3.2 攻毒用强毒的毒力测定结果
            3.3 攻毒试验结果
            3.4 间接ELISA检测方法的建立
                3.4.1 ELISA检测方法最佳条件的确定
                3.4.2 阴阳性判定标准确定
            3.5 间接ELISA检测抗体水平结果
        4 讨论
全文总结
参考文献
附录
致谢
简介
导师评阅表


【参考文献】：
期刊论文
[1]气肿疽研究综述[J]. 于建华,张皓,陈竞,金鑫.  黑龙江畜牧兽医. 2018(18)
[2]糖基化基因修饰对重组蛋白表达及活性的影响[J]. 周小菊,纳涛,马宁宁,袁宝珠.  中国生物制品学杂志. 2018(09)
[3]气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定[J]. 张皓,段雪岩,张永佳,车达,邓文学,李成辉,关如婷,金鑫.  黑龙江畜牧兽医. 2018(05)
[4]气肿疽梭菌检测方法概述[J]. 张皓,任春宇,车达,张永佳,李成辉,金鑫.  动物医学进展. 2017(09)
[5]牛气肿疽病的防控措施[J]. 乔双梅.  养殖与饲料. 2017(08)
[6]家畜气肿疽的研究进展[J]. 陈发喜,蔡扩军,范玉娟,何克明,王清平.  草食家畜. 2015(03)
[7]牛气肿疽病的诊治技术探讨[J]. 莫奉乙,杨恩忠,罗应华,董书恒,赵克华,和平.  畜禽业. 2015(02)
[8]一起牛气肿疽病的病例报道[J]. 赵小林,洪贵生,李荣兰.  中国牛业科学. 2014(01)
[9]黄牛气肿疽的诊治[J]. 李进.  畜禽业. 2013(08)
[10]蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析[J]. 赵大维,朱彦青,陈伟业,胡倩倩,殷倩倩,黄克和,步志高.  中国预防兽医学报. 2012(08)

硕士论文
[1]延边株气肿疽梭菌的分离鉴定及cctA基因的克隆和表达[D]. 云巾宴.延边大学 2015
[2]牛气肿疽CctA基因核酸疫苗的制备及免疫效果评价[D]. 齐强.延边大学 2017



本文编号：3706916