森林革蜱和草原革蜱PCR-RFLP鉴别方法的建立及线粒体基因组序列分析

发布时间：2017-05-16 20:27

  本文关键词：森林革蜱和草原革蜱PCR-RFLP鉴别方法的建立及线粒体基因组序列分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蜱是一类以吸食动物血液为生的体外寄生虫,虫体主要寄生于家畜和野生动物体表,也侵袭人类。蜱可以携带及传播多种病原体,包括细菌、病毒和寄生虫等,并且能通过直接叮咬造成蜱瘫、中毒和过敏,不仅给畜牧业造成巨大经济损失,还可严重影响人类健康,威胁公共卫生安全。森林革蜱(Dermacentor silvarum)和草原革蜱(Dermacentor nuttalli)是中国北方常见的两个蜱种,形态相似,通过形态学方法进行准确鉴定比较困难。因此,本研究第一部分内容是建立一种森林革蜱和草原革蜱的分子鉴定方法,即以核糖体内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列为基础建立森林革蜱和草原革蜱的PCR-RFLP方法。通过提取森林革蜱和草原革蜱的基因组DNA,设计引物,PCR扩增和测序,最终获得准确的森林革蜱和草原革蜱的ITS2序列,并运用DNAStar软件对所得序列的限制性片段长度多态性进行分析。研究发现,森林革蜱和草原革蜱ITS2的PCR扩增产物经限制性内切酶Spe I酶切后所得片段明显不同,森林革蜱ITS2 PCR产物不能被切开而草原革蜱则被切成两段。可见,运用PCR-RFLP方法可成功鉴别森林革蜱和草原革蜱。目前关于革蜱的研究主要局限于形态学、流行病学、综合防治及蜱传疾病等方面,而关于线粒体基因组方面的研究很少。因此,本实验第二部分内容是扩增森林革蜱线粒体的全基因组序列并对其结构特点进行分析,探讨革蜱属的进化分类关系。结果显示,森林革蜱线粒体基因组全长为14945 bp,由13个蛋白质编码基因、2个非编码区、22个t RNA和2个核糖体RNA构成,各基因排列顺序与后沟类硬蜱相似。森林革蜱整个线粒体基因组核苷酸组成为A=38.89%,T=39.89%,G=8.94%,C=12.29%,A+T含量为78.78%。在森林革蜱的线粒体基因组t RNA-Glu和nad1之间存在一个插入基因,长度为127bp,含有3个重复序列“similar to nad1”。运用BI、ML和MP三种方法分别以森林革蜱线粒体基因组的13个蛋白质编码基因为标记构建系统进化树,结果发现三种建树方法所得结果一致或相似,即进化树分为两大分支,后沟类硬蜱和前沟类硬蜱各形成一个分支,森林革蜱位于后沟类硬蜱分支上。在后沟类这一分支中,革蜱属、扇头蜱属和凹沟蜱属均形成单一分支,而花蜱属和血蜱属形成复分支。革蜱属与扇头蜱属亲缘关系较其它蜱属近。本研究首次建立了鉴别森林革蜱和草原革蜱的PCR-RFLP方法,为两种革蜱的鉴别提供了参考;首次对森林革蜱线粒体的全基因组进行测序,并对其基因特征进行比较分析,丰富了蜱的线粒体基因组数据,为进一步研究蜱分类及其进化关系奠定了基础。
【关键词】：森林革蜱 草原革蜱 PCR-RFLP 线粒体基因组 进化分析
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.746
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 文献综述10-32
• 1.1 草原革蜱和森林革蜱11-16
• 1.1.1 病原11
• 1.1.2 草原革蜱和森林革蜱的外部形态学特征11-13
• 1.1.3 生活史13
• 1.1.4 分类讨论13-14
• 1.1.5 流行病学14
• 1.1.6 蜱及蜱传病的症状及危害14-15
• 1.1.7 蜱及蜱传病的防治15-16
• 1.2 蜱分子分类研究进展16-17
• 1.3 蜱线粒体基因组研究进展17-30
• 1.3.1 蜱线粒体基因组测序完成概况17-20
• 1.3.2 蜱线粒体基因组的一般特征20-29
• 1.3.3 线粒体基因组在蜱中的应用29-30
• 1.4 研究的目的与意义30-32
• 第二章 森林革蜱与草原革蜱PCR-RFLP鉴别方法的建立32-42
• 2.1 材料与方法32-36
• 2.1.1 材料32-34
• 2.1.2 方法34-36
• 2.2 结果36-39
• 2.2.1 PCR扩增结果36
• 2.2.2 两种革蜱ITS2测序结果分析36-37
• 2.2.3 PCR-RFLP结果37-39
• 2.3 讨论39-42
• 第三章 森林革蜱线粒体全序列分析及系统发生研究42-70
• 3.1 材料与方法42-49
• 3.1.1 材料42-45
• 3.1.2 方法45-49
• 3.2 结果49-65
• 3.2.1 森林革蜱粒体基因组各段序列的PCR扩增及鉴定49-56
• 3.2.2 森林革蜱的线粒体全基因组序列分析56-61
• 3.2.3 序列分析61-64
• 3.2.4 进化分析64-65
• 3.3 讨论65-70
• 3.3.1 森林革蜱的线粒体基因组的结构特征65-66
• 3.3.2 蛋白质编码基因66-67
• 3.3.3 核糖体RNA和t RNA基因67-68
• 3.3.4 非编码区68
• 3.3.5 进化分析68-70
• 第四章 结论70-72
• 附录72-78
• 参考文献78-90
• 致谢90-92
• 个人简历92

【参考文献】

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本文编号：371868