STING基因敲除猪肺巨噬细胞系的构建及验证
发布时间：2022-12-11 20:29
天然免疫系统是机体抵抗外来微生物入侵的第一道防线。干扰素基因刺激因子STING（Stimulator of interferon genes）是天然免疫信号通路中重要的衔接蛋白。细胞内第二信使环磷酸鸟苷-腺苷（Cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,c GAMP）是STING的内源性激活剂,二者结合后可以活化STING/TBK1/IRF3信号通路,最终激活I型干扰素（Type I interferon）的表达。为了建立基于STING为靶点的抗病毒小分子化合物筛选工具,本文使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立了STING基因敲除猪肺巨噬细胞系。通过设计单链引导RNA（Single guide RNA,sg RNA）构建重组质粒pSTING-sgRNA,将质粒转染人胚胎肾细胞（Human embryonic kidney 293T/17,HEK293/T17）收取慢病毒并感染3D4/21猪肺巨噬细胞,经嘌呤霉素（Puromycin）筛选获得STING基因敲除多克隆细胞系。再通过有限稀释法,获得STIN...
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
英文缩略表
摘要
1.文献综述
1.1 天然免疫概述
1.2 天然免疫系统识别病原分子
1.2.1 Toll样受体家族
1.2.2 DNA识别受体家族
1.2.3 RNA识别受体家族
1.2.4 其他的PRRs
1.3 STING的发现及临床意义
1.3.1 STING的结构
1.3.2 STING的抗病毒机制
1.3.3 STING与G10
1.4 干扰素的简介
1.4.1 干扰素的分类
1.4.2 干扰素抗病毒的作用机制
1.4.3 干扰素刺激因子
1.5 伪狂犬病
1.5.1 伪狂犬病
1.5.2 PRV的生物学特性
1.5.3 PRV与DNA识别受体
1.6 CRISPR/Cas9的研究进展
1.6.1 CRISPR/Cas9的结构及原理
1.6.2 CRISPR/Cas9的优势及局限
1.7 展望
2.引言
3.材料与方法
3.1 材料
3.1.1 细胞和病毒
3.1.2 细胞培养耗材
3.1.3 感受态和质粒
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要试剂
3.1.6 常规生化试剂的配制
3.2 试验方法
3.2.1 E.coli Top10感受态的制备
3.2.2 引物设计与合成
3.2.2.1 sgRNA引物设计与合成
3.2.2.2 PCR克隆引物设计与合成
3.2.2.3 Q-PCR克隆引物设计与合成
3.2.3 pSTING-sgRNA载体构建
3.2.3.1 sgRNA引物退火
3.2.3.2 质粒酶切与回收
3.2.3.3 重组质粒的连接与转化
3.2.3.4 质粒提取
3.2.4 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系构建
3.2.4.1 STING-sgRNA慢病毒的包装
3.2.4.2 感染细胞筛选细胞系
3.2.4.3 细胞基因组提取
3.2.4.4 PCR扩增及切胶纯化
3.2.4.5 T7酶切检测
3.2.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选
3.2.6 酶标仪检测
3.2.7 荧光观察及流式检测
3.2.8 PRV病毒滴度的测定
3.2.8.1 病毒的扩增和收取
3.2.8.2 病毒滴度的测定
3.2.9 实时荧光定量PCR
3.2.9.1 细胞总RNA的提取
3.2.9.2 反转录合成cDNA
3.2.9.3 荧光定量PCR检测
3.2.9.4 mRNA相对表达量的计算
3.2.10 数据处理
4.结果与分析
4.1 猪STING-sgRNA重组质粒的构建及鉴定
4.1.1 52961质粒酶切结果
4.1.2 质粒测序结果
4.2 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系的构建
4.2.1 STING基因编辑效率的检测
4.2.2 T7酶切鉴定
4.3 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选
4.4 G10抑制PRV-GFP在3D4/21-WT细胞中的复制
4.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的鉴定
4.5.1 STING基因敲除对PRV-GFP病毒复制的影响
4.5.2 STING基因敲除对PRV-GFP和PRV-QXX病毒滴度的影响
4.5.3 STING基因敲除对ISG基因的影响
5.讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
英文摘要
本文编号：3719449
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
英文缩略表
摘要
1.文献综述
1.1 天然免疫概述
1.2 天然免疫系统识别病原分子
1.2.1 Toll样受体家族
1.2.2 DNA识别受体家族
1.2.3 RNA识别受体家族
1.2.4 其他的PRRs
1.3 STING的发现及临床意义
1.3.1 STING的结构
1.3.2 STING的抗病毒机制
1.3.3 STING与G10
1.4 干扰素的简介
1.4.1 干扰素的分类
1.4.2 干扰素抗病毒的作用机制
1.4.3 干扰素刺激因子
1.5 伪狂犬病
1.5.1 伪狂犬病
1.5.2 PRV的生物学特性
1.5.3 PRV与DNA识别受体
1.6 CRISPR/Cas9的研究进展
1.6.1 CRISPR/Cas9的结构及原理
1.6.2 CRISPR/Cas9的优势及局限
1.7 展望
2.引言
3.材料与方法
3.1 材料
3.1.1 细胞和病毒
3.1.2 细胞培养耗材
3.1.3 感受态和质粒
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要试剂
3.1.6 常规生化试剂的配制
3.2 试验方法
3.2.1 E.coli Top10感受态的制备
3.2.2 引物设计与合成
3.2.2.1 sgRNA引物设计与合成
3.2.2.2 PCR克隆引物设计与合成
3.2.2.3 Q-PCR克隆引物设计与合成
3.2.3 pSTING-sgRNA载体构建
3.2.3.1 sgRNA引物退火
3.2.3.2 质粒酶切与回收
3.2.3.3 重组质粒的连接与转化
3.2.3.4 质粒提取
3.2.4 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系构建
3.2.4.1 STING-sgRNA慢病毒的包装
3.2.4.2 感染细胞筛选细胞系
3.2.4.3 细胞基因组提取
3.2.4.4 PCR扩增及切胶纯化
3.2.4.5 T7酶切检测
3.2.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选
3.2.6 酶标仪检测
3.2.7 荧光观察及流式检测
3.2.8 PRV病毒滴度的测定
3.2.8.1 病毒的扩增和收取
3.2.8.2 病毒滴度的测定
3.2.9 实时荧光定量PCR
3.2.9.1 细胞总RNA的提取
3.2.9.2 反转录合成cDNA
3.2.9.3 荧光定量PCR检测
3.2.9.4 mRNA相对表达量的计算
3.2.10 数据处理
4.结果与分析
4.1 猪STING-sgRNA重组质粒的构建及鉴定
4.1.1 52961质粒酶切结果
4.1.2 质粒测序结果
4.2 3D4/21-STING~(-/-)多克隆细胞系的构建
4.2.1 STING基因编辑效率的检测
4.2.2 T7酶切鉴定
4.3 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的筛选
4.4 G10抑制PRV-GFP在3D4/21-WT细胞中的复制
4.5 3D4/21-STING~(-/-)单克隆细胞系的鉴定
4.5.1 STING基因敲除对PRV-GFP病毒复制的影响
4.5.2 STING基因敲除对PRV-GFP和PRV-QXX病毒滴度的影响
4.5.3 STING基因敲除对ISG基因的影响
5.讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
英文摘要
本文编号：3719449
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3719449.html
