吕氏泰勒虫TISP基因的克

发布时间：2022-12-18 03:44

　　羊泰勒虫病（Ovine and caprine theileriosis）是媒介蜱传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称。严重影响了畜牧业的发展。本研究从吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库中克隆出T1SP基因,通过构建原核重组表达质粒,进行诱导表达和纯化,得到重组rT1SP抗原。经Western-blot方法分析证实T1SP表达蛋白的反应性。经过真核转染用激光共聚焦显微技术对其在Vero细胞中表达蛋白进行定位,最后建立检测羊泰勒虫的间接ELISA方法。为今后羊泰勒虫病的免疫学诊断和基因工程疫苗的研究奠定基础。 克隆吕氏泰勒虫（Theileria luwenshuni）T1SP基因的功能区片段,以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板,PCR扩增出T1SP基因片段,构建成pET-30a-T1SP重组质粒,通过诱导表达,获得了可溶性表达蛋白,并对其用镍柱进行亲和层析纯化,得到重组rT1SP抗原,用Western-blot分析了T1SP表达蛋白与尤氏泰勒虫（T. uilenbergi）、绵羊泰勒虫（T. ovis）、以及环形泰勒虫（T. an... 

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

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英文缩略表
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 泰勒虫病的概况
        1.1.1 羊泰勒虫的分类
        1.1.2 羊泰勒虫的传播媒介
        1.1.3 泰勒虫的形态与致病情况
    1.2 羊泰勒虫的诊断方法
        1.2.1 血涂片检查
        1.2.2 聚合酶链式反应(PCR)
        1.2.3 间接荧光抗体技术(IFAT)
        1.2.4 半巢式PCR(semi-nested PCR)
        1.2.5 环介导的恒温扩增技术(LAMP)
        1.2.6 酶联免疫反应技术(ELISA)
    1.3 羊泰勒虫的研究现状
    1.4 研究目标
        1.4.1 吕氏泰勒虫T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表达
        1.4.2 吕氏泰勒虫T1SP基因在真核细胞的表达与定位
        1.4.3 T1SP抗原的间接ELISA抗体检测羊泰勒虫方法的建立
第2章 吕氏泰勒虫T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表达
    2.1 引言
    2.2 材料、试剂与仪器
        2.2.1 菌株、载体
        2.2.2 试验试剂
        2.2.3 试验仪器
        2.2.4 吕氏泰勒虫T1SP基因的生物信息学分析
    2.3 吕氏泰勒虫T1SP基因的克隆
        2.3.1 引物设计
        2.3.2 PCR扩增
        2.3.3 胶回收
        2.3.4 pGEM-T Easy载体的连接
        2.3.5 转化
        2.3.6 pGEM-T-T1SP质粒的提取
    2.4 重组表达质粒pET-30a-T1SP的构建
        2.4.1 双酶切
        2.4.2 连接
        2.4.3 PCR鉴定
    2.5 pET-30a-T1SP的原核表达
    2.6 表达蛋白的纯化与透析
        2.6.1 纯化
        2.6.2 透析
    2.7 Western-blot分析
        2.7.1 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳
        2.7.2 转膜(半干转)
    2.8 羊抗T1SP蛋白多抗的制备
    2.9 结果与分析
        2.9.1 T1SP基因的PCR扩增结果
        2.9.2 T1SP基因序列
        2.9.3 T1SP基因翻译的氨基酸序列
        2.9.4 T1SP基因抗原表位分析预测
        2.9.5 重组蛋白的表达和纯化
        2.9.6 Western-blot分析结果
    2.10 讨论
    2.11 小结
第3章 吕氏泰勒虫T1SP基因在真核细胞的表达与定位
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 T1SP基因的引物设计
        3.1.4 PCR扩增
        3.1.5 pEGFP-N1-T1SP重组质粒的构建
        3.1.6 重组质粒的提取
        3.1.7 Vero细胞的培养与转染
        3.1.8 细胞爬片的制作与亚细胞定位
        3.1.9 Western-blot分析重组质粒pEGFP-N1-T1SP的表达
    3.2 结果与分析
        3.2.1 T1SP基因的PCR扩增结果
        3.2.2 重组质粒pEGFP-N1-T1SP的PCR鉴定
        3.2.3 脂质体转染
        3.2.4 重组质粒pEGFP-N1-T1SP在Vero细胞中的定位
        3.2.5 表达与Western-blot分析
    3.3 讨论
    3.4 小结
第4章 rT1SP抗原的间接ELISA抗体检测羊泰勒虫方法的建立
    4.1 材料与方法
        4.1.1 血清
        4.1.2 抗原的制备
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 试验仪器
        4.1.5 抗原的最佳包被浓度
        4.1.6 血清和酶标抗体的稀释度
        4.1.7 间接ELISA判定标准
        4.1.8 交叉反应检测
        4.1.9 临床样品检测
    4.2 结果与分析
        4.2.1 抗原的最佳包被浓度
        4.2.2 血清和酶标抗体的稀释度
        4.2.3 临界值的判定标准
        4.2.4 交叉反应结果
        4.2.5 临床样品检测结果
        4.2.6 rT1SP蛋白多抗的持续时间
    4.3 讨论
    4.4 小结
结论
参考文献
致谢
附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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本文编号：3721268