猪原始生殖细胞体内跟踪、体外培养及遗传印记的研究

发布时间：2022-12-22 02:34

　　胚胎生殖细胞（EG）是从胎儿原始生殖细胞（PGCs）分离培养出来的具有发育多潜能性的一种多潜能干细胞。传统的胚胎干细胞（ES）多从囊胚的内细胞团（ICM）获得,如小鼠ES。但对大家畜而言,很难获得充足的囊胚,ES建系也还没有成功。自从PGCs来源的小鼠EG细胞建立后,通过检测mEG的生物学特性和mES相似,使人们有理由相信,由其他物种的PGCs也同样能够获得EG细胞。虽然关于猪EG细胞的获得早有报道,但是,至今仍然未能建成与小鼠ES和EG一样稳定的细胞系。原因是多方面的,一是我们对猪PGCs的发生、增殖、迁移等过程缺少了解；二是我们对猪PGCs的表观遗传学变化研究甚少;三是PGCs细胞体外培养体系仍有待完善。本研究选择猪胚胎发育22天至30天的生殖嵴为研究对象,通过组织切片技术对生殖嵴形态及PGCs在体内的迁移进行了跟踪；利用Realtime PCR及亚硫酸氢盐测序技术对印记基因的表达及甲基化水平进行了分析；通过对不同胎龄、不同饲养层、不同的传代方法的比较对类EG细胞的培养条件进行了优化,期望在认知猪PGCs体内生物学变化规律的基础上优化体外培养条件,最终获得稳定传代的猪EG细胞系。主... 

【文章页数】：87 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 猪多能干细胞研究进展
        1.1.1 胚胎干细胞(ES)的研究进展
        1.1.2 诱导多能干细胞(iPS)的研究进展
        1.1.3 胚胎生殖细胞(EG)的研究进展
    1.2 哺乳动物原始生殖细胞的发育
        1.2.1 原始生殖细胞特化的信号调控
        1.2.2 小鼠原始生殖细胞的迁移
        1.2.3 人原始生殖细胞的迁移
        1.2.4 猪原始生殖细胞的迁移
        1.2.5 原始生殖细胞甲基化的去除与重建
    1.3 胚胎生殖细胞培养的影响因素
        1.3.1 饲养层对胚胎生殖细胞的影响
        1.3.2 细胞生长因子对胚胎生殖细胞的影响
        1.3.3 胚胎日龄对胚胎生殖细胞的影响
        1.3.4 分离方法对胚胎生殖细胞的影响
        1.3.5 胚胎生殖细胞的传代
        1.3.6 胚胎生殖细胞的鉴定
    1.4 本研究的目的意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要仪器设备
        2.1.3 主要试剂及试剂盒
        2.1.4 常用试剂及配制
        2.1.5 主要的生物信息学网站及分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 猪生殖嵴组织学切片制作
        2.2.2 苏木素-伊红染色
        2.2.3 组织切片免疫荧光
        2.2.4 猪原始生殖细胞的分离
        2.2.5 Realtime PCR
        2.2.6 亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析
        2.2.7 胚胎生殖细胞培养用饲养层的制备
        2.2.8 胚胎生殖细胞的原代培养
        2.2.9 胚胎生殖细胞的传代培养
        2.2.10 猪胚胎生殖细胞的鉴定
3 结果与分析
    3.1 猪生殖嵴形态变化及原始生殖细胞跟踪
        3.1.1 猪生殖嵴形态变化跟踪
        3.1.2 猪原始生殖细胞在体内迁移跟踪
    3.2 猪原始生殖细胞印记基因表达的变化
        3.2.1 Realtime PCR反应的特异性
        3.2.2 印记基因的表达
    3.3 猪原始生殖细胞印记基因甲基化的变化
        3.3.1 IGF2基因的甲基化
        3.3.2 H19基因的甲基化
    3.4 猪胚胎生殖细胞的培养
        3.4.1 饲养层细胞的形态特征
        3.4.2 胚胎生殖细胞的形态特征
        3.4.3 不同胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响
        3.4.4 不同来源饲养层对胚胎生殖细胞培养的影响
        3.4.5 不同传代方式对胚胎生殖细胞培养的影响
        3.4.6 胚胎生殖细胞的鉴定
4 讨论
    4.1 猪原始生殖细胞的迁移
        4.1.1 生殖嵴的形成
        4.1.2 原始生殖细胞的迁移
    4.2 印记基因的研究
        4.2.1 DNA甲基化与基因表达
        4.2.2 印记基因的甲基化
    4.3 胚胎生殖细胞培养的影响因素
        4.3.1 饲养层细胞对胚胎生殖细胞培养的影响
        4.3.2 胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响
        4.3.3 胚胎生殖细胞的定向诱导分化
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]体外培养条件下SCF、LIF与bFGF对昆明白小鼠精原干细胞增殖的影响[J]. 尹明,李德雪.  生物工程学报. 2002(06)
[2]中国小型猪胚胎生殖细胞的培养和建系[J]. 丛笑倩,杜忠伟,芮荣,李秀兰,包林平,吴军,鲍世民,姚■.  细胞生物学杂志. 2003(06)
[3]The culture and establishment of embryonic germ（EG）cell lines from Chinese mini swine[J]. HSIAO CHIEN TSUNG.  Cell Research. 2003(03)
[4]人类胚胎生殖细胞体外分化为心肌细胞的研究[J]. 华进联,徐小明,窦忠英.  生物医学工程学杂志. 2006(05)
[5]干细胞多能性信号调控机制研究进展[J]. 王娟,孔庆然,王加强,刘忠华.  中国细胞生物学学报. 2011(10)
[6]ES细胞分化为血管样结构的机理探讨—TGF-β1在血管形成中的作用[J]. 丛笑倩,姚鑫.  实验生物学报. 1996(03)



本文编号：3723269